水稻白叶枯病菌及细菌性条斑病菌培养及接种
Cultivation of Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo and Inuculation of Rice   

材料与试剂

1. 枪头
   
2. 0.5 ml离心管
   
3. 注射器
   
4. Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo
   
5. Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc
   
6. Tryptone (Oxoid, England, catalog number: LP0042)
   
7. Agar (武汉创新生物技术有限公司，中国，catalog number: BM0212)
   
8. Na₂HPO₄·12H₂O (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
   
9. Ca(NO₃)₂·4H₂O (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
   
10. NaCl (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
11. KCl (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
12. KH₂PO₄ (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
13. 蔗糖 (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
14. 甘油(国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
15. 马铃薯培养基 (见溶液配方)
    
16. PBS (见溶液配方)
    

仪器设备

1. -70 °C冰箱
   
2. 超净工作台
   
3. 接种环
   
4. 温箱
   

实验步骤

一、水稻白叶枯病菌及细菌性条斑病菌的培养

1. 取出于-70 °C保存的菌株，于超净工作台上用灭菌枪头吸取菌液至土豆斜面培养基上，用灭菌接种环涂布均匀。
   
2. 置于28 °C温箱内培养3天，细菌长成亮黄色，可将其置于4 °C存放一个月，使用时按照步骤1中所述方法将其转接至新的培养基上。
   
3. 再次转接后的生根管置于28 °C温箱内培养2天，细菌长成亮黄色，可用于保存菌株或接种实验。
   
   

二、水稻白叶枯病菌及细菌性条斑病菌的菌株保存
上述步骤3中培养好的菌体，若需长久保存菌株时，向生根管中加入10-30 ml灭菌的30%甘油，与菌体混匀后，分装至灭菌的0.5 ml离心管中，置于-70 °C长久保存。

三、水稻白叶枯病菌的接种及调查方法

1. 菌体于28 °C温箱内培养2天长成亮黄色后，用PBS溶液稀释，采用比浊法将浓度稀释至约9 x 10⁹个细菌/ml。
   
2. 接种采用剪叶法，于水稻孕穗期接种 (也可于水稻幼苗期接种)。接种时用剪刀蘸取菌液，剪去剑叶 (幼苗期接种时选取完全伸展的叶片接种) 叶尖约2 cm长部分。每个单株至少接种5片剑叶。
   
3. 通常在接种14天或21天后进行调查。调查时量取病斑长度及病叶长度，依据病斑面积 (病斑长度/病叶长度) 衡量病情。每个单株至少调查5片剑叶。
   
   

四、水稻细菌性条斑病菌的接种及调查方法

1. 细菌的培养及稀释同白叶枯病菌。
   
2. 接种采用渗透法(视频1)或针刺法(视频2)，于水稻幼苗期或孕穗期接种。幼苗期接种时选取完全伸展的叶片接种，孕穗期接种时选取剑叶接种。采用渗透法接种时，用一次性注射器吸取菌液，将注射口按住叶片，用力推动注射器，使菌液通过压力渗入叶片内。采用针刺法接种时，用一次性注射器吸取菌液后，将注射口装上针头，推动注射器使针孔中充满菌液，之后将针头刺入叶片，菌液随针头被带入叶片内。
   
   
   
   视频1. 渗透法接种水稻细菌性条斑病
   
   
   
   视频2. 针刺法接种水稻细菌性条斑病
   
   
3. 通常在接种14天或21天后进行调查。调查时用刻度尺测量病斑长度，每个单株至少测量5片剑叶并取其平均值作为该单株的发病长度。(图1)
   
   
   图1. 水稻白叶枯病及细菌性条斑病接种结果示意图
   
   

注：

溶液配方

1. 马铃薯培养基
   

   马铃薯	300g (去皮煮熟后过滤取汁液)
   Na2HPO4·12H2O	2 g
   Ca(NO3)2·4H2O	0.5 g
   Tryptone	5 g
   蔗糖	15 g
   Agar	20 g

   加蒸馏水至1 L，调pH至6.8-7.0，分装至生根管中，封口后灭菌，趁热将生根管倾斜待培养基凝固，使培养基在生根管中形成斜面。
   
2. PBS

   NaCl	8 g
   KCl	0.2 g
   Na2HPO4·12H2O	3.628 g
   KH2PO4	0.24 g

   加入灭菌去离子水至终体积为1 L，用NaOH或HCl调节pH至7.4。