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水稻白叶枯病菌及细菌性条斑病菌培养及接种
Cultivation of Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo and Inuculation of Rice   

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实验原理:水稻白叶枯病由稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)引起,自然条件下由水稻的伤口或水孔侵入水稻叶片,进入木质部进行繁殖,由叶片向叶鞘侵染,最终造成叶片枯萎。水稻细菌性条斑病由稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)引起,自然条件下由水稻的气孔或伤口侵入水稻叶片,病斑起初为暗绿色水渍状,沿叶脉扩展呈细线状,严重时同样造成叶片枯萎。本实验介绍了这两种细菌的培养、接种及调查方法。
实验目的:鉴定水稻对白叶枯病菌及细菌性条斑病菌的抗性情况。

关键词: 水稻白叶枯病菌, 水稻细菌性条斑病菌, 细菌培养, 接种, 病情调查

材料与试剂

  1. 枪头
  2. 0.5 ml离心管
  3. 注射器
  4. Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo
  5. Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc
  6. Tryptone (Oxoid, England, catalog number: LP0042)
  7. Agar (武汉创新生物技术有限公司,中国,catalog number: BM0212)
  8. Na2HPO4·12H2O (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
  9. Ca(NO3)2·4H2O (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
  10. NaCl (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
  11. KCl (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
  12. KH2PO4 (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
  13. 蔗糖 (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
  14. 甘油(国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
  15. 马铃薯培养基 (见溶液配方)
  16. PBS (见溶液配方)

仪器设备

  1. -70 °C冰箱
  2. 超净工作台
  3. 接种环
  4. 温箱

实验步骤

一、水稻白叶枯病菌及细菌性条斑病菌的培养

  1. 取出于-70 °C保存的菌株,于超净工作台上用灭菌枪头吸取菌液至土豆斜面培养基上,用灭菌接种环涂布均匀。
  2. 置于28 °C温箱内培养3天,细菌长成亮黄色,可将其置于4 °C存放一个月,使用时按照步骤1中所述方法将其转接至新的培养基上。
  3. 再次转接后的生根管置于28 °C温箱内培养2天,细菌长成亮黄色,可用于保存菌株或接种实验。

二、水稻白叶枯病菌及细菌性条斑病菌的菌株保存
上述步骤3中培养好的菌体,若需长久保存菌株时,向生根管中加入10-30 ml灭菌的30%甘油,与菌体混匀后,分装至灭菌的0.5 ml离心管中,置于-70 °C长久保存。

三、水稻白叶枯病菌的接种及调查方法

  1. 菌体于28 °C温箱内培养2天长成亮黄色后,用PBS溶液稀释,采用比浊法将浓度稀释至约9 x 109个细菌/ml。
  2. 接种采用剪叶法,于水稻孕穗期接种 (也可于水稻幼苗期接种)。接种时用剪刀蘸取菌液,剪去剑叶 (幼苗期接种时选取完全伸展的叶片接种) 叶尖约2 cm长部分。每个单株至少接种5片剑叶。
  3. 通常在接种14天或21天后进行调查。调查时量取病斑长度及病叶长度,依据病斑面积 (病斑长度/病叶长度) 衡量病情。每个单株至少调查5片剑叶。

四、水稻细菌性条斑病菌的接种及调查方法

  1. 细菌的培养及稀释同白叶枯病菌。
  2. 接种采用渗透法(视频1)或针刺法(视频2),于水稻幼苗期或孕穗期接种。幼苗期接种时选取完全伸展的叶片接种,孕穗期接种时选取剑叶接种。采用渗透法接种时,用一次性注射器吸取菌液,将注射口按住叶片,用力推动注射器,使菌液通过压力渗入叶片内。采用针刺法接种时,用一次性注射器吸取菌液后,将注射口装上针头,推动注射器使针孔中充满菌液,之后将针头刺入叶片,菌液随针头被带入叶片内。

    视频1. 渗透法接种水稻细菌性条斑病

    视频2. 针刺法接种水稻细菌性条斑病

  3. 通常在接种14天或21天后进行调查。调查时用刻度尺测量病斑长度,每个单株至少测量5片剑叶并取其平均值作为该单株的发病长度。(图1)


    图1. 水稻白叶枯病及细菌性条斑病接种结果示意图

注:

1)
温度为25-30 °C、湿度高的环境容易发病,温度过低或过高、空气湿度过低时发病情况差。因此接种时应留意环境条件的变化。
2)
接种应在可控制的条件下进行,避免造成病菌扩散,导致疫情。
3)
水稻细菌性条斑病为全国植物检疫性病害之一,应慎重接种。

溶液配方

  1. 马铃薯培养基
    马铃薯
    300g (去皮煮熟后过滤取汁液)
    Na2HPO4·12H2O
    2 g
    Ca(NO3)2·4H2O
    0.5 g
    Tryptone
    5 g
    蔗糖
    15 g
    Agar
    20 g
    加蒸馏水至1 L,调pH至6.8-7.0,分装至生根管中,封口后灭菌,趁热将生根管倾斜待培养基凝固,使培养基在生根管中形成斜面。
  2. PBS
    NaCl
    8 g
    KCl
    0.2 g
    Na2HPO4·12H2O
    3.628 g
    KH2PO4
    0.24 g
    加入灭菌去离子水至终体积为1 L,用NaOH或HCl调节pH至7.4。
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Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:马海港, 袁猛. (2018). 水稻白叶枯病菌及细菌性条斑病菌培养及接种. Bio-101: e1010180. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010180.
How to cite: Ma, H. G. and Yuan, M. (2018). Cultivation of Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo and Inuculation of Rice. Bio-101: e1010180. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010180.
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