柑橘试管嫁接
Tube Grafting Citrus   

材料与试剂

1. 封口膜
   
2. 滤纸
   
3. 玻璃皿
   
4. 柑橘果实
   
5. 4% NaOH
   
6. 3% NaClO
   
7. 播种培养基 (详见柑橘组培常用培养基配制方法 [杨雯惠等，2018]) 
   
8. 液体生根培养基 (见溶液配方)
   

仪器设备

1. 刀
   
2. 三角瓶
   
3. 镊子
   
4. 手术刀
   
5. 光培室
   
6. 超净工作台
   
7. 暗培养箱
   
8. 电子天平
   
9. pH计
   

实验步骤

1. 砧木准备
   1.1

   在果实成熟期采收枳、枳橙等的果实，取出种子，将种子用4% NaOH溶液浸泡约10 min，去除种子表面的果胶，然后剥去其外种皮，用3% NaClO溶液对种子消毒处理15 min。
   
   1.2

   于无菌条件下，用镊子剥去种子内种皮，将种子播于播种培养基 (MT培养基，蔗糖减少为25 g) 中，暗培养30-40 d左右，选取生长粗壮、未木质化的黄化苗用于试管嫁接。
2. 嫁接 (超净工作台)
   2.1

   于嫁接前提前准备好灭菌的铺有滤纸的玻璃皿，含滤纸桥的液体生根培养基 (见溶液配方)。
   
   2.2

   砧木处理：将枳黄化苗从试管中取出，置于铺有滤纸的培养皿中，用手术刀在子叶上下各1.5-2.0 cm处去掉部分茎和根，在茎段顶部切一个深度约为0.3-0.5 cm的切口。
   
   2.3

   接穗处理：将未生根的组培苗置于培养皿的滤纸上，用手术刀将其茎上的叶片全部切除，再将其切为1-2 cm左右的茎段，随后将茎段基部削成楔形后快速插入到砧木的切口中，使其与砧木切口紧密吻合。
   
   2.4

   嫁接完毕后，立即将其放入带有滤纸桥的液体生根培养基中，最后置于光照培养室中培养。
   注：

   1)

   滤纸桥即为滤纸中间插一个小孔，具有支撑试管苗的作用。
   

   2)

   嫁接时，确保砧木和接穗至少有一边对齐，便于伤口愈合。
   

   3)

   整个操作过程均在无菌条件下进行，且动作要快，防止失水。
   

   4)

   在光照条件下培养，伤口愈合后，及时清除砧木切口处的萌蘖；待伤口充分愈合，且接穗芽长出新叶后，即可将其炼苗并移入温室。

溶液配方

1. 生根培养基

   MT培养基	50 ml/L
   大量元素	25 g/L蔗糖
   NAA	0.5 mg/L
   IBA	0.1 mg/L
   活性炭	0.5 g/L

   pH：5.86-5.88

参考文献

1. 杨雯惠，解凯东，郭文武. (2018). 柑橘组织培养常用培养基配制方法. Bio-101 e1010184. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010184.
2. Trevor A. T. and Edward C. Y. (Eds.) (2011). Plant embryo culture: methods and protocols [M]. Humana Press.