实验原理:在利用根癌农杆菌介导的基因遗传转化过程中,首先要得到携带目的基因载体的农杆菌菌株。细胞经过CaCl2处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞,即感受态细胞。农杆菌感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备,即用低渗CaCl2溶液在低温 (0 °C) 时处理快速生长的细菌,从而获得感受态。此时细菌膨胀成球形,外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面,通过热激作用促进细胞对DNA的吸收进而实现载体质粒的农杆菌转化。
实验目的:制备农杆菌感受态细胞,将表达载体质粒转 (以pK7WG2D_Cs7g29500-ox为例) 入农杆菌感受态细胞中,获得携带表达载体的农杆菌菌株用于基因遗传转化。
关键词: 农杆菌, 感受态, 制备, 热激转化
材料与试剂
- 各种型号枪头
- 各种型号离心管
- 吸水纸
- GV3101农杆菌菌株
- NaCl
- 胰蛋白胨
- 酵母提取物
- 琼脂粉
- 利福平 (50 mg/ml)
- CaCl2
- 壮观霉素
- 甘油
- 0.02 mol/L CaCl2 (见溶液配方)
- CaCl2/15%甘油混合液 (见溶液配方)
- LB培养基 (见溶液配方)
仪器设备
- 恒温培养箱
- 超净工作台
- 恒温摇床
- 冷冻高速离心机
- -80 °C超低温冰箱
- 4 °C冰箱
- 分光光度计
实验步骤
- 农杆菌感受态制备
- 农杆菌热激转化
注意事项
- 操作过程均为无菌操作,在超净工作台上完成。
- 常用农杆菌菌株主要有两种:GV3101 (多用于转化拟南芥和烟草)、EHA105 (多用于转化柑橘和愈伤组织)。
溶液配方
- 0.02 mol/L CaCl2
0.22198 g CaCl2溶解于100 ml双蒸水中,121 °C、15 min灭菌
- CaCl2/15%甘油混合液
0.1099 g CaCl2,7.5 ml甘油,加双蒸水定容至50 ml,121 °C、15 min灭菌
- LB培养基
1 L固体LB培养基成分为10 g NaCl、10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、15 g琼脂粉,加水定容至1 L,121 °C、15 min灭菌。液体LB不加琼脂粉
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