柑橘挥发性物质提取与鉴定
Extraction and Identification of Volatile Substances from Citrus   

材料和试剂

1. 2 ml离心管
2. 1 ml注射器
3. 0.22 μm滤膜 (SCAA-104)
4. 2 ml进样瓶
5. 200 μl内插管
6. 柑橘组织
7. 液氮
8. Methyl tert-butyl ether (MTBE)
9. 壬酸甲酯 (Sigma-Aldrich)
10. 提取液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 电子秤
2. 涡旋仪
3. GC-MS (TRACE GC Ultra GC, DSQ II mass spectrometer, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)
4. TRACE TR-5 MS column (30 m x 0.25 mm x 0.25 μl, Thermo Scientific，Bellefonte, PA, USA)
5. Eppendrof centrifuge 5424R
6. 超声波清洗仪 (DTG-15J)
7. 研钵
   

实验步骤

1. 柑橘组织在研钵中液氮下研磨成粉。
2. 称取柑橘组织 (黄皮层0.2 g，汁胞1 g, 叶片0.3 g) 装入2 ml离心管中，加入500 μl超纯水，涡旋混合均匀。
3. 再加入500 μl提取液，涡旋混合均匀。
4. 4 °C冰浴，超声波萃取40 min。
5. 4 °C，10,000 x g离心10 min，分层。
6. 用1 ml注射器吸取上清液，用0.22 μm滤膜过滤进上样瓶 (内插管)。
7. GC-MS上机检测。
   

结果与分析

1. GC-MS检测条件
   GC-MS (TRACE GC Ultra GC结合DSQ II mass spectrometer) 的进样量为1 μl，色谱柱为TRACE TR-5 MS柱 (30 m x 0.25 mm x 0.25 μl)。载气为高纯氦气(99.999%)，分流比50:1，恒流模式，流速为1 ml/min。进样口，离子源和传输线的温度分别为250 °C、260 °C和280 °C。GC的升温程序如下：40 °C保持3 min，然后以3 °C/min的速度升温至160 °C并保留1 min，然后以5 °C/min的速度升温至200 °C并保留1 min，最后以8 °C/min的速度升温至240 °C并保留3 min。MS的条件如下：EI (电子轰击) 离子源，电子轰击能量70 eV，正离子扫描模式，质量扫描范围m/z 45-400 amu。
   
2. 检测结果如图1所示
   
   
   图1. 柑橘挥发性物质GC-MS检测色谱图 (部分). A：β-月桂烯
   

注意事项

1. 叶片分流比20:1；汁胞：不分流
   

溶液配方

1. 提取液 (20ml)
   

   试剂	含量
   壬酸甲酯	1 μl
   MTBE	20 ml

参考文献

1. Liu, C., Cheng, Y., Zhang, H., Deng, X., Chen, F. and Xu, J. (2012). Volatile constituents of wild citrus Mangshanyegan (Citrus nobilis Lauriro) peel oil. J Agric Food Chem 60(10): 2617-2628.
2. Zhang, H., Xie, Y., Liu, C., Chen, S., Hu, S., Xie, Z., Deng, X. and Xu, J. (2017). Comprehensive comparative analysis of volatile compounds in citrus fruits of different species. Food Chem 230: 316-326.