果蝇胚胎原位杂交实验方案
In situ Hybridization in Drosophila Embryos   

材料与试剂

一、一次性耗材

1. 离心管50 ml，10 ml
2. 一次性枪头1,000 μl，200 μl，100 μl，10 μl
3. 一次性吸管，容量为3 ml
4. 15 cm培养皿
5. 软毛笔
6. 尼龙网
7. 纱网
8. 小圆片 (Zweckform Verstaerkungsringe, catalog number: 3510)
9. 铝箔纸
10. 1.5 ml离心管
11. 玻片：20 mm × 40 mm，厚度小于20 μm
    玻片首先用浓硫酸浸泡过夜，用大量去离子水清洗，再用RNase free水冲洗3遍，放在脱色架上，60 °C烘干，用锡箔纸包好，室温保存备用。使用时用玻璃刀从中间划分为两半，即20 mm × 20 mm的大小作为载玻片。同时用玻璃刀把20 mm × 40 mm的玻片平均分成3份，即20 mm × 13 mm大小的作为盖玻片。
    

1. 指甲油
2. 显色剂 (BM Purple) (Roche, catalog number: 11442074001)，直接使用
3. 无水乙醇
4. 正庚烷 (heptane)
5. RNase AWAY (Invitrogen, catalog number: 7491543)
6. Paraformaldehyde (北京益利精细化学品有限公司)
7. NaCl (北京精细化工有限公司)
8. Triton X-100
9. 次氯酸钠溶液
10. KCl
11. Na₂HPO₄•12H₂O
12. KH₂PO₄
13. NaOH
14. 无水甲醇
15. Sucrose (北京益利精细化学品有限公司)
16. Agar (石狮市环球琼胶工业有限公司)
17. Apple Juice (汇源100%苹果汁)
18. Tween-20 (Sigma, catalog number: P1379)
19. Bovine serum albumin (BSA) (华美Sino-American Biotec, BP 0042)
20. Ficoll^TM (华美Sino-American Biotec, BIO 322)
21. PVP (华美Sino-American Biotec, BR 2205)
22. 柠檬酸钠 (北京精细化工有限公司)
23. HCl
24. Formamide (Amresco, catalog number: 1167B35)
25. Torula RNA, Type IX (Sigma, catalog number: R3629)
26. Heparin (Sigma, catalog number: H3125)
27. Sonicated salmon sperm DNA (Stratagene, catalog number: 201190)
28. CHAPS (Sigma, catalog number: C3023)
29. MgCl₂
30. Levamisol, an inhibitor of endogenous phosphatase (Sigma, catalog number: L9756)
31. Maleic Acid (ACROS, catalog number: 110-16-7, MW = 116.07)
32. EGTA (Amresco, catalog number: 0732) 
33. EDTA (Amresco, catalog number: 0322) 
34. Tris (Amresco, catalog number: 0497)
35. Proteinase K (Amresco, catalog number: 0706) 
36. 0.1 M三乙醇胺 (Triethanolamine) (上海生工, catalog number: TT0776, MW = 149.9) 
37. 乙酸酐 (Acctic anhydride) (属于毒品原料，需要经特殊部门批准方可购买)
38. 多聚甲醛（Paraformaldehyde，北京益利精细化学品有限公司）
39. RNase A (BBI, catalog number: RB0473) 
40. 封闭剂, Blocking Reagent (Roche, catalog number: 11096176001)
41. 羊血清原液 (中杉金桥ZL1-9021)
42. Anti-Dig-AP抗体 (Roche, catalog number: 11093274910)
43. 甘油 (汕头市西陇化工有限公司) 
44. RNase free水 (见溶液配方)
45. 甲醛固定液 (终浓度为8%) (见溶液配方)
46. 胚胎洗液 (见溶液配方)
47. 漂白液 (见溶液配方)
48. 10× PBS (pH = 7.4) (见溶液配方)
49. PTw (见溶液配方)
50. 0.5 M EGTA (见溶液配方)
51. 0.5 M EDTA (见溶液配方)
52. 1 M Tris (见溶液配方)
53. Proteinase K (见溶液配方)
54. 0.1 M三乙醇胺 (Triethanolamine) 溶液 (见溶液配方)
55. 乙酸酐 (Acctic anhydride) (见溶液配方)
56. 4%多聚甲醛 (见溶液配方)
57. 50× Denhardt’s Solution (见溶液配方)
58. 20× SSC (见溶液配方)
59. 杂交液 (whole mount hybridization buffer) (见溶液配方)
60. RNase A 储存液(见溶液配方)
61. AP Buffer (Alkaline Phosphatase Buffer) (见溶液配方)
62. 5× MAB (Maleic Acid Buffer, pH = 7.5) (见溶液配方)
63. 封闭剂 (Blocking Reagent) (见溶液配方)
64. 羊血清封闭液 (见溶液配方)
65. Anti-Dig-AP抗体溶液(见溶液配方)
66. 甘油溶液 (见溶液配方)

仪器设备

1. 玻璃器皿
   量筒1,000 ml，500 ml，250 ml，100 ml，50 ml，25 ml，10 ml
   烧杯1,000 ml，500 ml，400 ml，250 ml，200 ml，100 ml，50 ml
   细口瓶1,000 ml
   称量瓶20 ml
   玻璃棒
   蓝口瓶
2. 孵育器皿
   容量为4 ml的带密闭瓶盖的玻璃小瓶
3. 镊子

注：所有玻璃器皿和金属用具进行无RNA酶处理，具体操作：洗净烘干后用锡箔纸封口，180 °C烘烤4小时。所有不能烘烤的器皿用大量RNase free水冲洗，然后用擦镜纸沾取RNase AWAY (Invitrogen) 擦拭。实验台面用纸巾沾取无水乙醇擦拭。

4. 多道计时器
5. MilliQ纯水仪 (Millipore)
6. 水浴锅 (电热恒温水箱) (北京市长风仪器仪表公司, model: HHW21)
7. DHG恒温鼓风干燥箱 (山东德瑞克仪器有限公司)
8. 微量恒温器 (北京市方通达科技有限公司, model: TDW-1)
9. 全自动数显立式高压蒸汽灭菌器 (青岛胜方分析仪器有限公司, model: YXQ-LS-50SII)
10. 电子秤 (Acculab, model: ALC-11002) 及微量电子称 (Sartorius, model: CP124S)
11. pH计 (Sartorius, model: PB-10)
12. 摇床 (Heidolph, model: Polymax 1040)
13. 体式显微镜 (麦克奥迪, model: SMZ168，需要配20倍的目镜)
14. 冷光源 (北京福凯仪器有限公司, model: LGY-150)
15. Leica DM 2500显微镜
16. 微波炉
17. 通风橱
18. -20 °C冰箱
19. 移液器
20. 37 °C烘箱
21. 电磁炉

实验步骤

一、配制收集胚胎的各种溶液 (Kosman等，2004)

1. 制作产卵碟
   
   1.1

   在500 ml烧杯中加入：
   7.5 g sucrose (北京益利精细化学品有限公司)
   7.5 g agar (石狮市环球琼胶工业有限公司)
   75 ml Apple Juice (汇源100%苹果汁)
   150 ml去离子水
   1.2

   用玻璃棒搅拌均匀，放入微波炉内加热煮沸。煮沸至产生大量气泡取出，略微冷却至较少气泡，再次煮沸，取出，如此反复2到3次 (第一次煮沸气泡消融很慢，多次煮沸后，气泡较快消失，此时琼脂完全变性，即可取出)。
   1.3

   选择直径15 cm培养皿若干，打开盖子，并集中水平放置。将琼脂溶液依次倒入培养皿中 (每个培养皿约20 ml)，培养皿静置到琼脂凝固，盖好盖子备用。
   1.4

   使用前将煮熟的酵母，点在已经凝固的产卵碟中间。
2. 甲醛固定液 (Fixation Solution) 10 ml
3. 胚胎洗液 (Embryo Wash Buffer) 1 L
4. 漂白液 (Bleach Solution) 20 ml

1. 胚胎的收集
   收集4~5日龄果蝇，放入25 °C黑暗环境产卵，第一次预产卵1小时，更换产卵碟，正式产卵4~16个小时。
2. 胚胎的固定和保存
   
   2.1

   在产卵碟中倒入一些胚胎洗液，用软毛笔将胚胎轻轻刷到尼龙网上，再用大量的胚胎洗液冲掉胚胎上附着的酵母。
   2.2

   把纱网和胚胎一起浸泡在漂白液培烧皿 (直径4 cm磨口盖) 中2~3分钟，期间轻轻摇动漂白液。这样可以去掉胚胎表面的绒毛膜。
   2.3

   交替使用胚胎洗液和去离子水冲洗胚胎5~6次，彻底洗去漂白液，最后一次冲洗用RNase free水，这样胚胎会聚集在一起，用软毛笔轻刷胚胎团，胚胎团很容易就附着在毛笔上。
   2.4

   把胚胎团放入固定液瓶中，固定液中的两种成分互不相溶，正庚烷在上层，固定液在下层。这时胚胎会自动散开，均匀分布在正庚烷和固定液中间。盖上固定液瓶子的盖子，并将其放在摇床上，室温25转/分 (最大设置) 摇动25分钟。
   2.5

   把固定液瓶从摇床上取下，放在通风橱中静置几分钟使正庚烷和固定液中间的气泡消散，或者用吸管把气泡驱散。用吸管尽量吸走下层的固定液，这时瓶中只剩下胚胎和上层的正庚烷。
   2.6

   加入8 ml无水甲醇，此时甲醇和正庚烷仍旧是分层的，甲醇在下层，胚胎会在中间层。盖上瓶盖，用力摇20~30秒后放回通风橱中静置。去掉卵黄膜的胚胎会沉底。留在中间，瓶壁和上层可能是没有去掉卵黄膜的胚胎，所以不可要。用吸管吸掉上层的正庚烷，中间层的胚胎和二分之一的甲醇，只在瓶中留下底部的胚胎和二分之一的甲醇。
   2.7

   用吸管把胚胎和甲醇一起转移到一个新小玻璃瓶 (容量为4 ml) 中，吸掉多余的甲醇后加2 ml新鲜甲醇洗胚胎，如此用甲醇洗三次后，再用无水乙醇洗4次。这样的胚胎浸泡在无水乙醇中，放入-20 °C冰箱中，可以长时间保存。

第一天杂交 (保持无RNA酶污染)
以进行5瓶胚胎原位杂交为例，第一天需要的溶液量如下：

1. 复水 (rehydrate)
   
   1.1

   把胚胎从-20 °C冰箱中取出，室温放置15分钟。
   1.2

   用吸管吸掉100%乙醇，加入4 ml 75%乙醇 (25% MilliQ H₂O)，室温放置5分钟。
   1.3

   用吸管吸掉75%乙醇，加入4 ml 50%乙醇 (50% MilliQ H₂O)，室温放置5分钟。
   1.4

   用吸管吸掉50%乙醇，加入4 ml 25%乙醇 (75% PTw)，室温放置5分钟。
   1.5

   用吸管吸掉25%乙醇，加入4 ml PTw，室温放置5分钟。
   1.6

   用吸管吸掉PTw，加入4 ml PTw，室温放置5分钟。
2. 用吸管吸掉PTw，加入4 ml 5%甲醛溶液，放在摇床上20转/分钟，室温固定25分钟。
3. 用吸管吸掉甲醛溶液，加入4 ml PTw，室温静置5分钟。
4. 用吸管吸掉PTw，加入4 ml PTw，室温静置5分钟。重复该步骤3次。
5. 用吸管吸掉PTw，加入10 μg/ml Proteinase K溶液，室温孵育5分钟。此步时间要精确，静置，不能放在摇床上。
6. 用吸管吸掉Proteinase K溶液，加入4 ml 0.1 M三乙醇胺溶液，室温静置5分钟。
7. 用吸管吸掉三乙醇胺溶液，加入4 ml 0.1 M三乙醇胺溶液，室温静置5分钟。
8. 用吸管吸掉三乙醇胺溶液，加入4 ml乙酸酐溶液A，室温静置5分钟。
9. 用吸管吸掉乙酸酐溶液A，加入4 ml 乙酸酐溶液B，室温静置5分钟。
10. 用吸管吸掉乙酸酐溶液B，加入4 ml PTw，室温静置5分钟。
11. 用吸管吸掉PTw，加入4 ml PTw，室温静置5分钟。
12. 用吸管吸掉PTw，加入4 ml 4%多聚甲醛溶液，放在摇床上20转/分，室温20分钟。
13. 用吸管吸掉多聚甲醛溶液，加入4 ml PTw，室温静置5分钟。
14. 用吸管吸掉PTw，加入4 ml PTw，室温静置5分钟。重复该步骤4次。
15. 用吸管吸掉PTw，加入0.5 ml已预热的杂交液，放入60 °C水浴锅中10分钟。
16. 用吸管吸掉杂交液，加入0.5 ml已预热的杂交液，放入60 °C水浴锅中，预杂交4~6个小时。
17. 用200 μl移液器吸掉杂交液，加入0.4 ml探针液，放入60 °C水浴锅中过夜杂交。

第二天 洗涤和抗体孵育
以做5瓶胚胎原位杂交为例，第二天需要的溶液量如下：

1. 提前打开37 °C烘箱。 2× SSC和0.2× SSC应提前分装好，分别按用量放入60 °C，37 °C和室温下备用。
2. 回收探针液，加入0.5 ml回收杂交液，60 °C水浴锅中10分钟。此步骤中的探针液可回收后供下次使用，可以重复使用5次。
3. 用吸管吸掉回收杂交液，加入4 ml 2× SSC，60 °C水浴锅中10分钟。此步骤中杂交液要丢弃。
4. 用吸管吸掉2× SSC，加入4 ml 2× SSC，60 °C水浴锅中20分钟。重复此步骤3次。
5. 用吸管吸掉2× SSC，加入4 ml 20 μg/ml RNase A溶液，在37 °C孵育30分钟。
6. 用吸管吸掉RNase A溶液，加入4 ml 2× SSC，室温静置10分钟。
7. 用吸管吸掉2× SSC，加入4 ml 0.2× SSC在60 °C水浴锅中30分钟。
8. 用吸管吸掉0.2× SSC，加入4 ml 0.2× SSC在60 °C水浴锅中30分钟。
9. 用吸管吸掉0.2× SSC，加入4 ml 1× MAB，室温静置10分钟。
10. 用吸管吸掉1× MAB，加入4 ml 1× MAB，室温静置10分钟。
11. 用吸管吸掉1× MAB，加入0.5 ml 2% blocking reagent，摇床20转/分钟，室温封闭1小时。
12. 用吸管吸掉2% blocking reagent，加入0.5 ml 2% blocking reagent，20%羊血清，摇床20转/分钟，室温封闭1小时。
13. 用200 μl移液器吸掉2% blocking reagent，20%羊血清，加入0.4 ml 1/2,500 Anti-dig-AP抗体溶液，摇床20转/分钟，室温孵育4小时。
14. 用200 μl移液器吸掉抗体溶液，加入4 ml 1× MAB，室温静置5分钟。
15. 用吸管吸掉1× MAB，加入4 ml 1× MAB，摇床20转/分钟，室温1小时。重复该步骤至少5次。最后一次可以在4 °C过夜。

第三天 洗涤和染色
以做5瓶胚胎原位杂交为例，第三天需要的溶液量如下：

1. 用吸管吸掉1× MAB，加入4 ml AP buffer，室温静置5分钟。
2. 用吸管吸掉AP buffer，加入4 ml AP buffer，室温静置5分钟。
3. 用吸管吸掉AP buffer，加入0.4 ml BM purple，避光染色。
   此时需注意观察，如果BM purple变色 (浅紫)，可以换掉加入新鲜的BM purple。如希望染色慢些，可以放入4 °C。染色时间由于探针的不同而不同，有些探针10分钟就有信号，有些探针染色时间则长达3天。
4. 当信号明显时，用吸管吸掉BM purple，加入4 ml AP buffer，室温静置5分钟。
5. 用吸管吸掉AP buffer，加入4 ml AP buffer，室温静置5分钟。
6. 用吸管吸掉AP buffer，加入4 ml PTw，室温静置5分钟。
7. 用吸管吸掉PTw，加入4 ml PTw室温静置10分钟，该步骤可以重复2~3次。
8. 用吸管吸掉PTw，加入0.6 ml 50% glycerol，等几小时后样品沉底。
9. 用吸管吸掉50% glycerol，加入0.6 ml 70% glycerol，此时的胚胎可以封片拍照也可以放入-20 °C保存。
10. 封片：将两片小圆片 (Zweckform Verstaerkungsringe) 重叠后，贴在载玻片上，加入7 μl 70% glycerol，用样品勺依次把3~5个样品放入，用镊子夹着一根头发丝，在显微镜下把样品的位置摆正后，在小圆片周围涂上指甲油，不能太多和太少，与小圆片等高即可。用镊子将切好尺寸的盖玻片盖上。并在玻片上记下探针名称，果蝇品系和封片时间。
    

溶液配方

1. RNase free水
   使用高温烘烤后的细口瓶，接取纯水仪处理后的超纯水，用铝箔纸将瓶口裹紧，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min，冷却至室温后使用
2. 甲醛固定液 (终浓度为8%) 10 ml
   
   
3. 胚胎洗液 (1 L)
   100 ml 1 M NaCl
   0.4 ml Triton X-100
   加RNase free水定容至1 L
4. 漂白液 (20 ml)
   10 ml 次氯酸钠溶液
   10 ml RNase free水
5. 10× PBS (pH = 7.4) 
   
   以配制1,000 ml 10× PBS为例：
   
   1)

   称量80.06 g NaCl；2.01 g KCl；35.81 g Na₂HPO₄•12H₂O; 2.72 g KH₂PO₄加入1,000 ml烧杯中
   2)

   加入800 ml RNase free水，把烧杯放在设定为60 °C的水浴锅中，同时用玻璃棒搅拌使颗粒溶解
   3)

   用10 M NaOH溶液调pH值至7.4 (大约1,200 µl)
   4)

   用1,000 ml量筒定容后，倒入蓝口瓶中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min。保存于室温
   用RNase free水稀释10× PBS配制成1× PBS
6. PTw
   1× PBS + 0.1% Tween-20 (使用当天配)
   以配制1,000 ml PTw为例：
   用1,000 ml量筒量取1,000 ml 1× PBS
   加入1 ml Tween-20，充分混匀
7. 0.5 M EGTA
   以配制100 ml 0.5 M EGTA溶液为例：
   
   1)

   称量19.02 g EGTA加入到250 ml烧杯中
   2)

   加入80 ml RNase free水，把pH计电极浸入溶液中，缓慢加入NaOH颗粒，同时用玻璃棒搅动
   3)

   等溶液澄清后用10 M NaOH溶液调pH值为8.0
   4)

   用100 ml量筒定容为100 ml，倒入蓝口瓶中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min，保存于室温
8. 0.5 M EDTA
   以配制100 ml 0.5 M EDTA溶液为例：
   
   1)

   称量14.6 g EDTA加入到250 ml烧杯中
   2)

   加入80 ml RNase free水，把pH计电极浸入溶液中，缓慢加入NaOH颗粒，同时用玻璃棒搅动
   3)

   等溶液澄清后用10 M NaOH溶液调pH值为8.0
   4)

   用100 ml量筒定容为100 ml，倒入蓝口瓶中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min，保存于室温
9. 1 M Tris
   1 M Tris溶液分为三种，分别为pH = 7.5、pH = 7.8、pH = 9.5
   以配制100 ml pH = 9.5 1 M Tris溶液为例：
   
   1)

   称量12.11 g Tris加入到250 ml烧杯中
   2)

   加入80 ml RNase free水，用玻璃棒搅拌使颗粒溶解
   3)

   用浓盐酸调pH值为9.5
   4)

   用100 ml量筒定容为100 ml，倒入蓝口瓶中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min，保存于室温
10. Proteinase K
    以配制1 ml 10 mg/ml储存液为例：
    
    1)

    称量10 mg Proteinase K，加入到1.5 ml离心管中
    2)

    加入980 μl RNase free水、10 μl 1 M Tris (pH 7.8)、10 μl 0.5 M EDTA (pH 8.0)充分混合均匀，但不可以剧烈震荡
    3)

    分装为22 μl/管，保存在-20 °C冰箱
    使用时吸取10 μl加入到10 ml PTw中，混匀后就是10 μg/ml Proteinase K溶液
    
11. 0.1 M三乙醇胺 (Triethanolamine) 溶液 (使用当天配)
    以配制100 ml 0.1 M三乙醇胺溶液为例：
    
    1)

    在200 ml烧杯中加入大约90 ml RNase free水
    2)

    加入1.332 ml三乙醇胺，用玻璃棒搅拌均匀
    3)

    用浓盐酸调pH值至7.8
    4)

    用RNase free水在100 ml量筒定容至100 ml
    (所加浓盐酸的量为各次经验值，仅供参考)：
    
    
12. 乙酸酐 (Acctic anhydride) (使用当天配)
    乙酸酐溶液A (以配制100 ml乙酸酐溶液A为例)：
    
    1)

    用100 ml量筒量取100 ml 0.1 M三乙醇胺溶液
    2)

    加入250 μl乙酸酐充分混合均匀
    3)

    乙酸酐溶液B (以配制100 ml乙酸酐溶液B为例)：
    4)

    用100 ml量筒量取100 ml 0.1 M三乙醇胺溶液
    5)

    加入500 μl乙酸酐充分混合均匀
    注：乙酸酐属于毒品原料，需要经特殊部门批准方可购买，其配制需在通风橱中进行。
13. 4%多聚甲醛
    
    1)

    打开恒温水浴箱电源，设置温度为60 °C
    2)

    称量2 g多聚甲醛 (Paraformaldehyde)，放入200 ml烧杯中
    3)

    加入45 ml RNase free水，15 µl 10 M NaOH溶液，用锡箔纸密封烧杯口
    4)

    把烧杯放在60 °C水浴锅中加热20分钟，中间轻轻摇动烧杯几次，等待溶液澄清后取出烧杯，放在冰上冷却
    5)

    加入5 ml 10× PBS，仍旧用锡箔纸密封，放在4 °C冰箱中，三天内均可使用
14. 50× Denhardt’s Solution (100 ml)
    1 g Bovine serum albumin (BSA) 1% (w/v)
    1 g Ficoll^TM 1% (w/v)
    1 g PVP 1% (w/v)
    用RNase free水定容至100 ml，分装为1 ml/管，-20 °C保存
15. 20× SSC (pH = 7.0) (1 L)
    
    1)

    称量175.3 g NaCl；88.2 g柠檬酸钠加入1,000 ml烧杯中
    2)

    加入800 ml RNase free水，把烧杯放在设定为60 °C的加热器上，同时用玻璃棒搅拌使颗粒溶解
    3)

    用浓HCl调pH值至7.0
    4)

    用1,000 ml量筒定容后，倒入蓝口瓶中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min。保存于室温
    用RNase free水稀释20× SSC配制成2× SSC，0.2× SSC
16. 杂交液 (whole mount hybridization buffer)
    杂交液中含有的封闭成分比较多，有利于降低杂交的背景。溶液配好后放在-20 °C保存。
    
    注：杂交液的配制需在通风橱中进行。
    
17. RNase A储存液
    一般配制成10 mg/ml的储液。以配制10 ml为例：
    
    1)

    称量100 mg RNase A加入到20 ml称量瓶中
    2)

    加入9 ml RNase free水、100 μl 1 M Tris (pH 7.5)、150 μl 1 M NaCl，用一个1 ml枪头搅拌溶液，使之溶解
    3)

    用电磁炉煮沸一锅水，把称量瓶放入沸水中15分钟
    4)

    取出称量瓶，放在室温下等溶液冷却至室温
    5)

    用10 ml量筒定容至10 ml
    6)

    分装为22 μl/管，保存在-20 °C冰箱
    使用时吸取20 μl加入到中10 ml 2× SSC，混匀后就是20 μg/ml RNase A溶液
18. AP Buffer (Alkaline Phosphatase Buffer) (使用当天配)
    
    
19. 5× MAB (Maleic Acid Buffer，pH = 7.5)
    以配制1,000 ml 5× MAB为例：
    
    1)

    称量58.04 g Maleic Acid，43.83 g NaCl加入1,000 ml烧杯中
    2)

    加入800 ml RNase free水，把pH计电极浸入溶液，慢慢加入NaOH颗粒，同时用玻璃棒搅拌，当pH值达到7.0时Maleic Acid才会完全溶解
    3)

    用10 M NaOH溶液调pH值至7.5
    4)

    用1,000 ml量筒定容后，倒入蓝口瓶中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min。保存于室温
20. 封闭剂 (Blocking Reagent)
    一般配成10%储存液。以配制50 ml储存液为例：
    
    1)

    称量5 g封闭剂放入100 ml烧杯中
    2)

    加入约40 ml 1× MAB，用玻璃棒搅拌均匀，并水浴锅中60~80 °C加热溶解
    3)

    用1× MAB 在50 ml量筒定容至50 ml，倒入离心管中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min
    4)

    分装为1 ml/管，放于-20 °C保存
    5 ml胚胎用2% block reagent：
    4 ml 1× MAB
    1 ml 10% block reagent
21. 羊血清封闭液
    封闭用正常羊血清原液 (10 ml/瓶)
    灭活：
    
    1)

    把羊血清放入56 °C水浴锅中，加热30分钟
    2)

    取出放在冰上冷却，分装为1 ml/管
    3)

    放入-20 °C冰箱保存
    5 ml 胚胎用2% block reagent和20%羊血清封闭液：
    3 ml 1× MAB
    1 ml 10% block reagent
    1 ml 羊血清
22. Anti-Dig-AP抗体溶液
    胚胎用抗体的准备35 ml (30 ml)：
    
    1)

    1× MAB 5.6 ml (4.8 ml) +羊血清1.4 ml (1.2 ml) 在4 °C预冷10分钟
    2)

    加14 μl (12 μl) Anti-Dig-AP在4 °C孵育1个小时
    3)

    加入10% blocking reagent 7 ml (6 ml)，1× MAB 15.4 ml (13.2 ml)，羊血清5.6 ml (4.8 ml)
23. 甘油溶液
    
    1)

    50%甘油
    用25 ml量筒称量25 ml 1× PBS，倒入50 ml离心管中，然后直接向离心管中倒入甘油至管壁上50 ml刻度线处。充分混合均匀放在4 °C冰箱
    2)

    70%甘油
    用25 ml量筒称量15 ml 1× PBS，倒入50 ml离心管中，然后直接向离心管中倒入甘油至管壁上50 ml刻度线处。充分混合均匀放在4 °C冰箱 
    

致谢

该文章得到国家自然科学基金 (31571033，91632107) 和中国科学院前沿重点研究计划 (QYZDY-SSW-SMC015) 的资助；该实验方案改编自中国科学院生物物理研究所温省云博士毕业论文 (2012)；使用该实验方案发表的文章：Li等 (2012和2014)。

参考文献

1. Inagaki, S., Numata, K., Kondo, T., Tomita, M., Yasuda, K., Kanai, A. and Kageyama, Y. (2005). Identification and expression analysis of putative mRNA-like non-coding RNA in Drosophila. Genes Cells 10(12): 1163-1173.
2. Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W. and Bier, E. (2004). Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science 305(5685): 846.
3. Li, M., Wen, S., Guo, X., Bai, B., Gong, Z., Liu, X., Wang, Y., Zhou, Y., Chen, X., Liu, L. and Chen, R. (2012). The novel long non-coding RNA CRG regulates Drosophila locomotor behavior. Nucleic Acids Res 40(22): 11714-11727.
4. Li, M., Xu, M., Wen, S., Bai, B., Chen, R. and Liu, L. (2014). One novel long noncoding RNA lnc10 in Drosophila. J Genet Genomics 41(2): 79-82.
5. Tautz, D. and Pfeifle, C. (1989). A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma 98(2): 81-85.