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果蝇成蝇脑原位杂交实验方案
In situ Hybridization in Adult Drosophila Brain   

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实验原理:在一定的温度和离子浓度下,使具有地高辛标记的特异序列的RNA探针通过碱基互补规则与成蝇脑组织中待测的RNA结合,之后通过探针上所标记的检测系统将待测RNA在成蝇脑中的位置进行定位。
实验目的:检测某种特定RNA在成蝇脑组织细胞中的表达分布情况。

关键词: RNA探针, 地高辛, 脑组织, 成蝇

材料与试剂

一、 实验器具

  1.  一次性耗材
    离心管50 ml,10 ml
    一次性枪头1,000 μl,200 μl,100 μl,10 μl
    保鲜膜
    小圆片 (Zweckform Verstaerkungsringe, catalog number: 3510)
    铝箔纸
  2. 孵育器皿
    48孔细胞培养板 (Cellstar, catalog number: 677180)
  3. 解剖器具
  4. 玻片:20 mm × 40 mm,厚度小于20 μm
    玻片首先用浓硫酸浸泡过夜,用大量去离子水清洗,再用RNase free水冲洗3遍,放在脱色架上,60 °C烘干,用锡箔纸包好,室温保存备用。使用时用玻璃刀从中间划分为两半,即20 mm × 20 mm的大小作为载玻片。同时用玻璃刀把20 mm × 40 mm的玻片平均分成3份,即20 mm × 13 mm大小的作为盖玻片
    1)
    解剖用塑料培养皿 (直径55 mm):其底部要铺一层胶 (Dow Corning, catalog number: Sylgard® 184),这样可避免镊子尖碰到底部时被弄弯
    2)
    培烧皿 (直径约4厘米带有磨口的盖子):内装少量脱脂棉,并倒入少许75%的酒精。在解剖时当镊子尖端附着组织时,可以轻轻把镊子在酒精棉上擦拭,把镊子尖端的组织去掉

二、 溶液与试剂
  1. 甲醛
  2. Glycerol
  3. 指甲油
  4. KCl
  5. Na2HPO4•12H2O
  6. KH2PO4
  7. NaOH
  8. Tween-20 (Sigma, catalog number: P1379)
  9. Triton X-100 (ICN Biomedicals, catalog number: 58404)
  10. 浓盐酸
  11. RNase AWAY (Invitrogen, catalog number: 7491543)
  12. Bovine serum albumin (BSA) (华美Sino-American Biotec BP 0042)
  13. FicollTM (华美Sino-American Biotec BIO 322)
  14. PVP (华美Sino-American Biotec BR 2205)
  15. NaCl (北京精细化工有限公司)
  16. 柠檬酸钠 (北京精细化工有限公司)
  17. Formamide (Amresco, catalog number: 1167B35)
  18. Torula RNA (Type IX) (Sigma, catalog number: R3629)
  19. Sonicated salmon sperm DNA (Stratagene, catalog number: 201190)
  20. CHAPS (Sigma, catalog number: C3023)
  21. Heparin (Sigma, catalog number: H3125)
  22. MgCl2
  23. Levamisol, an inhibitor of endogenous phosphatase (Sigma, catalog number: L9756)
  24. 羊血清原液 (中杉金桥, catalog number: ZL1-9021)
  25. DMF (Dimethylformamide, 二甲基甲酰胺) (防化学院化工厂)
  26. NBT (硝基四氮唑蓝) (Amresco, catalog number: E1181)
  27. BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸) (Amresco, catalog number: E1041)
  28. EDTA (Amresco, catalog number: 0322, MW = 292.25)
  29. Tris (Amresco, catalog number: 0497, MW = 121.14)
  30. RNase A (BBI, catalog number: RB0473)
  31. 封闭剂 (Blocking Reagent) (Roche, catalog number: 11096176001)
  32. Anti-Dig-AP抗体 (Roche, catalog number: 11093274910)
  33. 甘油 (汕头市西陇化工有限公司)
  34. RNase free水 (见溶液配方)
  35. 10× PBS (pH = 7.4) (见溶液配方)
  36. PTw (见溶液配方)
  37. PTX (见溶液配方)
  38. 0.5 M EDTA (见溶液配方)
  39. 1 M Tris (见溶液配方)
  40. 50× Denhardt’s Solution (100 ml) (见溶液配方)
  41. 20× SSC (pH = 7.0) (见溶液配方)
  42. 杂交液 (whole mount hybridization buffer) (见溶液配方)
  43. RNase A储存液 (见溶液配方)
  44. AP Buffer (Alkaline Phosphatase Buffer) (见溶液配方)
  45. 封闭剂 (Blocking Reagent) (见溶液配方)
  46. 羊血清封闭液 (见溶液配方)
  47. Anti-Dig-AP抗体溶液 (见溶液配方)
  48. NBT/BCIP显色剂 (见溶液配方)
  49. 甘油溶液 (见溶液配方)
注:所需溶液均须用RNase free水配制,提前配好并在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min。

仪器设备

注:所有玻璃器皿和金属用具进行无RNA酶处理,具体操作:洗净烘干后用锡箔纸封口,180 °C烘烤4小时。所有不能烘烤的器皿用大量RNase free水冲洗,然后用擦镜纸沾取RNase AWAY (Invitrogen) 擦拭。实验台面用纸巾沾取无水乙醇擦拭。

  1. 玻璃器皿
    量筒1,000 ml,100 ml,50 ml,25 ml,10 ml
    烧杯1,000 ml,400 ml,250 ml,200 ml,100 ml,50 ml
    细口瓶1,000 ml
    称量瓶20 ml
    玻璃棒
    蓝口瓶
  2. 镊子:DUMONT #5一把;DUMONT #55一把
  3. 样品勺:是取果蝇脑样本的关键,一般用直径0.5 mm铂金丝制作而成 (普通的不锈钢和铜丝易生锈影响实验,而且这些材料质地不够细密,易粘果蝇的组织)
  4. MilliQ纯水仪 (Millipore)
  5. 水浴锅 (电热恒温水箱) (北京市长风仪器仪表公司, model: HHW21)
  6. DHG恒温鼓风干燥箱 (山东德瑞克仪器有限公司)
  7. 微量恒温器 (北京市方通达科技有限公司, model: TDW-1)
  8. 全自动数显立式高压蒸汽灭菌器 (青岛胜方分析仪器有限公司, model: YXQ-LS-50SII)
  9. 电子秤 (Acculab, model: ALC-11002) 及微量电子称 (Sartorius, model: CP124S)
  10. pH计 (Sartorius, model: PB-10)
  11. 体式显微镜 (麦克奥迪, model: SMZ168,需要配20倍的目镜)
  12. 冷光源 (北京福凯仪器有限公司, model: LGY-150)
  13. 多道计时器
  14. Leica DM 2500显微镜
  15. 移液器
  16. 冰箱 (4 °C和-20 °C)
  17. 加热器
  18. 电磁炉

实验步骤

实验步骤参考Inagaki等,(2005);Li等,(2012和2014);Tautz和Pfeifle,(1989)。

第一天
一、 解剖和固定 (保持无RNA酶污染)
以做5孔成蝇脑原位杂交为例,第一天需要的溶液量:

  1. 在预冷的1× PBS中解剖成蝇脑,用样品勺把解剖好的成蝇脑转移到固定液中。尽量解剖干净一些,去掉所有能看到的气囊丝。在培养板上选择5个孔,每个孔中加入0.6 ml 8%甲醛溶液,把培养板放在冰上。解剖一个固定一个,每个孔中放5个成蝇脑。
  2. 成蝇脑在8%甲醛溶液中4 °C过夜固定。

第二天

二、 杂交 (保持无RNA酶污染)
以做5孔成蝇脑原位杂交为例,第二天需要溶液量:

PTw
12 ml
杂交液
2 ml
5种RNA探针液 (终浓度:10~50 ng/μl)
各0.3 ml
  1. 用PTw室温洗涤3 × 10 min:在48孔板上依次加入600 μl PTw,用样品勺把样品从8%甲醛溶液中转移到PTw孔中,10分钟后转移到下一个孔中,共3次。
  2. 把杂交液在85~90 °C中加热5~7分钟,然后放在冰上快速冷却至少5分钟。
  3. 在48孔板上加入0.2 ml PTw,再加入0.2 ml杂交液,混匀后,用样品勺把样品从PTw中转移到混合液中。
  4. 重新打开一个48孔板,在孔中加入0.3 ml杂交液,用样品勺把样品转移到杂交液中,用保鲜膜包裹住48孔板,放入60 °C水浴锅中,预杂交至少1个小时,最好4~5个小时。
  5. 把探针液在85~90 °C中加热5~7分钟,然后放在冰上快速冷却至少5分钟。
  6. 在48孔板中加入0.3 ml探针液,用样品勺把样品从杂交液中转移到探针液中,用保鲜膜包裹住48孔板,放入60 °C水浴锅中,过夜杂交。
注:步骤4中用的杂交液应回收成为回收杂交液。

第三天

三、 洗涤和抗体孵育
以做5孔成蝇脑原位杂交为例,第三天需要的溶液量:


  1. 在48孔板上加入0.3 ml回收杂交液,用样品勺把样品从探针液中转移到回收杂交液中。60 °C水浴锅中,10分钟。回收探针液。
  2. 在48孔板上加入0.3 ml 4:1杂交液:PTw,用样品勺把样品从回收杂交液中转移到4:1杂交液:PTw中。60 °C水浴锅中,20分钟。
  3. 在48孔板上加入0.3 ml 4:1杂交液:PTw,用样品勺把样品从回收杂交液中转移到4:1杂交液:PTw中。60 °C水浴锅中,20分钟。
  4. 在48孔板上加入0.3 ml 3:2杂交液:PTw,用样品勺把样品从4:1杂交液:PTw中转移到3:2杂交液:PTw中。60 °C水浴锅中,20分钟。
  5. 在48孔板上加入0.4 ml 2:3杂交液:PTw,用样品勺把样品从3:2杂交液:PTw中转移到2:3 杂交液:PTw中。60 °C水浴锅中,20分钟。
  6. 在48孔板上加入0.4 ml 1:4杂交液:PTw,用样品勺把样品从2:3杂交液:PTw中转移到1:4杂交液:PTw中。60 °C水浴锅中,20分钟。
  7. 用PTw在60 °C水浴锅中洗涤5 × 20 min:在48孔板上依次加入600 μl PTw,用样品勺把样品从1:4杂交液:PTw中转移到PTw孔中,20分钟后转移到下一个孔中,共5次。
  8. 在48孔板上加入0.6 ml 2× SSC,用样品勺把样品从PTw中转移到2× SSC中。室温静置5分钟。
  9. 在48孔板上加入0.4 ml 20 μg/ml RNase A溶液,用样品勺把样品从2x SSC中转移到20 μg/ml RNase A溶液中。在37 °C水浴锅中孵育30分钟。
  10. 在48孔板上加入0.6 ml 2x SSC,用样品勺把样品从RNase A溶液中转移到2xSSC中。室温静置5分钟。
  11. 用PTX在室温洗涤2 x 20 min:在48孔板上依次加入600 μl PTX,用样品勺把样品从2x SSC中转移到PTX孔中,20分钟后转移到下一个孔中,共2次。
  12. 在48孔板上加入0.3 ml 0.5% block reagent溶液,用样品勺把样品从2x SSC中转移到0.5% block reagent溶液中。室温封闭至少1个小时。
  13. 在48孔板上加入0.3 ml 0.5% block reagent和10%羊血清溶液,用样品勺把样品从0.5% block reagent溶液中转移到0.5% block reagent和10%羊血清溶液中。室温封闭至少1个小时。
  14. 在48孔板上加入0.3 ml提前在胚胎中孵育后的抗体溶液,用样品勺把样品从0.5% block reagent和10%羊血清溶液中转移到抗体溶液中。4 °C过夜孵育。

第四天

四、 洗涤和染色

PTX
40 ml
AP buffer
10 ml (2 ml用来配染色剂)
NBT/BCIP染色剂
2 ml (2 ml AP buffer + 9 μl NBT + 7 μl BCIP)
  1. 在48孔板上依次加入600 μl PTX,用样品勺把样品从抗体溶液中转移到PTX孔中,室温静置5分钟。回收抗体溶液,放在4 °C冰箱保存。
  2. 用PTX在室温洗涤5 × 20 min:在48孔板上依次加入600 μl PTX,用样品勺把样品从PTX中转移到PTX孔中,20分钟后转移到下一个孔中,共5次。
  3. 在48孔板上依次加入600 μl RNase free水,用样品勺把样品从PTX中转移到RNase free水孔中,室温静置3分钟。
  4. 用AP buffer在室温洗涤2 × 5 min:在48孔板上依次加入600 μl AP buffer,用样品勺把样品从RNase free水中转移到AP buffer孔中,5分钟后转移到下一个孔中,共2次。
  5. 在48孔板上依次加入400 μl染色剂,用样品勺把样品从AP buffer中转移到染色剂孔中,避光染色,注意观察信号强弱。
    注:此时需注意观察,如果染色剂变色 (浅紫),可以换掉加入新鲜的染色剂。如希望染色慢些,可以放入4 °C。染色时间由于探针的不同而不同,有些探针10分钟就有信号,有些探针染色时间则长达3天。
  6. 染色完成后,在48孔板上依次加入600 μl蒸馏水,用样品勺把样品从染色剂中转移到蒸馏水孔中,室温静置3分钟。
  7. 用PTX在室温洗涤4 × 60 min:在48孔板上依次加入600 μl PTX,用样品勺把样品从蒸馏水中转移到PTX孔中,60分钟后转移到下一个孔中,共4次。
  8. 在48孔板上依次加入400 μl 50% glycerol,用样品勺把样品从PTX中转移到50% glycerol孔中,几个小时后样品沉底。
  9. 在48孔板上依次加入400 μl 70% glycerol,用样品勺把样品从50% glycerol中转移到70% glycerol孔中,此时样品既可以封片拍照也可以放入-20 °C保存。
  10. 封片:将两片小圆片重叠后,贴在载玻片上,加入7 μl 70% glycerol,用样品勺依次把3~5个样品放入,用镊子夹着一根头发丝,在显微镜下把样品的位置摆正后,在小圆片周围涂上指甲油,不能太多和太少,和小圆片等高即可。用镊子将切好尺寸的盖玻片盖上。并在玻片上记下探针名称,果蝇品系,封片时间。

溶液配方

  1. RNase free水
    使用高温烘烤后的细口瓶,接取纯水仪处理后的超纯水,用铝箔纸将瓶口裹紧,在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min,冷却至室温后使用
  2. 10× PBS (pH = 7.4)

    以配制1,000 ml 10× PBS为例:
    1)
    称量80.06 g NaCl;2.01 g KCl;35.81 g Na2HPO4•12H2O; 2.72 g KH2PO4加入1,000 ml烧杯中
    2)
    加入800 ml RNase free水,把烧杯放在设定为60 °C的水浴锅中,同时用玻璃棒搅拌使颗粒溶解
    3)
    用10 M NaOH溶液调pH值至7.4 (大约1,200 µl)
    4)
    用1,000 ml量筒定容后,倒入蓝口瓶中,在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min。保存于室温
    用RNase free水稀释10× PBS配制成1× PBS
  3. PTw
    1× PBS + 0.1% Tween-20 (使用当天配)
    以配制1,000 ml PTw为例:
    用1,000 ml量筒量取1,000 ml 1× PBS
    加入1 ml Tween-20,充分混匀
  4. PTX
    1× PBS + 0.3% Triton X-100 (使用当天配)
    以配制1,000ml PTX为例:
    用1,000 ml量筒量取1,000 ml 1× PBS
    加入3 ml Triton X-100,充分混匀
  5. 0.5 M EDTA
    以配制100 ml 0.5 M EDTA溶液为例:
    1)
    称量14.6 g EDTA加入到250 ml烧杯中
    2)
    加入80 ml RNase free水,把pH计电极浸入溶液中,缓慢加入NaOH颗粒,同时用玻璃棒搅动
    3)
    等溶液澄清后用10 M NaOH溶液调pH值为8.0
    4)
    用100 ml量筒定容为100 ml,倒入蓝口瓶中,在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min,保存于室温
  6. 1 M Tris
    1 M Tris溶液分为三种,分别为pH = 7.5、pH = 7.8、pH = 9.5
    以配制100 ml pH = 9.5 1 M Tris溶液为例:
    1)
    称量12.11 g Tris加入到250 ml烧杯中
    2)
    加入80 ml RNase free水,用玻璃棒搅拌使颗粒溶解
    3)
    用浓盐酸调pH值为9.5
    4)
    用100 ml量筒定容为100 ml,倒入蓝口瓶中,在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min,保存于室温
  7. 50x Denhardt’s Solution (100 ml)
    1 g Bovine serum albumin (BSA) 1% (w/v)
    1 g FicollTM 1% (w/v)
    1 g PVP 1% (w/v)
    用RNase free水定容至100 ml,分装为1 ml/管,-20 °C保存
  8. 20× SSC (pH = 7.0) (1 L)
    1)
    称量 175.3 g NaCl;88.2 g柠檬酸钠加入1,000 ml烧杯中
    2)
    加入800 ml RNase free水,把烧杯放在设定为60 °C的加热器上,同时用玻璃棒搅拌使颗粒溶解
    3)
    用浓HCl调pH值至7.0
    4)
    用1,000 ml量筒定容后,倒入蓝口瓶中,在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min。保存于室温
  9. 杂交液 (whole mount hybridization buffer)
    提供两个配方供参考,在与RNA探针杂交实验中使用配方1,因为其中含有的封闭成分比较多,有利于降低杂交的背景。但在杂交后的洗涤中使用不含sperm DNA的配方2,因为洗涤的要求不高,使用成分少的杂交液可以降低实验成本。溶液配好后放在-20 °C保存
    杂交液配方1

    杂交液配方2

  10. RNase A储存液
    一般配制成10 mg/ml的储液。以配制10 ml为例:
    1)
    称量100 mg RNase A加入到20 ml称量瓶中
    2)
    加入9 ml RNase free水、100 μl 1 M Tris (pH 7.5)、150 μl 1 M NaCl, 用1 ml枪头搅拌溶液,使之溶解
    3)
    用电磁炉煮沸一锅水,将称量瓶放入沸水中15分钟
    4)
    取出称量瓶,放在室温下自然冷却至室温
    5)
    用10 ml量筒定容至10 ml
    6)
    分装为22 μl/管,保存在-20 °C冰箱
    使用时吸取20 μl加入到中10 ml 2× SSC,混匀后即为20 μg/ml RNase A溶液
  11. AP Buffer (Alkaline Phosphatase Buffer) (使用当天配)

  12. 封闭剂 (Blocking Reagent)
    一般配成10%储存液。以配制50 ml储存液为例:
    1)
    称量5 g封闭剂放入100 ml烧杯中
    2)
    加入约40 ml 1× MAB,用玻璃棒搅拌均匀,并水浴锅中60~80 °C加热溶解
    3)
    用1× MAB在50 ml量筒定容至50 ml,倒入离心管中,在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min
    4)
    分装为1 ml/管,放于-20 °C保存
    20 ml成蝇脑用0.5% block reagent:
    19 ml 1× PTX
    1 ml 10% block reagent
  13. 羊血清封闭液
    封闭用正常羊血清原液 (10 ml/瓶)
    灭活:
    1)
    把羊血清放入56 °C水浴锅中,加热30分钟
    2)
    取出放在冰上冷却,分装为1 ml/管
    3)
    放入-20 °C冰箱保存
    20 ml成蝇脑用0.5% block reagent和10%羊血清封闭液:
    17 ml 1× PTX
    1 ml 10% block reagent
    2 ml 羊血清
  14. Anti-Dig-AP抗体溶液
    成蝇脑用抗体的准备
    1)
    首先把胚胎处理至胚胎原位杂交步骤中复水后的胚胎 (李美霞等,2019)
    2)
    用10%羊血清 (in PTX) 在4 °C预孵育胚胎1个小时
    3)
    按照1:2,000的比例加入抗体Anti-Dig-AP在4 °C孵育12个小时
  15. NBT/BCIP显色剂
    1)
    每毫升AP Buffer中加入4.5 μl NBT保存液和3.5 μl BCIP保存液
    2)
    在0.7 ml DMF (dimethylformamide,二甲基甲酰胺) 中加入0.3 ml RNase free水,混合均匀后为70% DMF
    3)
    NBT保存液:75 mg NBT (硝基四氮唑蓝) 溶解于1 ml 70%的DMF,分装为200 μl/管,-20 °C避光保存,保存期为1年
    4)
    BCIP保存液:50 mg BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸) 溶解于1 ml 100%的DMF,分装为200 μl/管,-20 °C避光保存,保存期为1年
  16. 甘油溶液
    1)
    50%甘油
    用25 ml量筒称量25 ml 1× PBS,倒入50 ml离心管中,然后直接向离心管中倒入甘油至管壁上50 ml刻度线处。充分混合均匀放在4 °C冰箱
    2)
    70%甘油
    用25 ml量筒称量15 ml 1× PBS,倒入50 ml离心管中,然后直接向离心管中倒入甘油至管壁上50 ml刻度线处。充分混合均匀放在4 °C冰箱

致谢

该文章得到国家自然科学基金 (31571033,91632107) 和中国科学院前沿重点研究计划 (QYZDY-SSW-SMC015) 的资助;该实验方案改编自中国科学院生物物理研究所温省云博士毕业论文 (2012);使用该实验方案发表的文章:Li等 (2012和2014)。

参考文献

  1. 李美霞,温省云,许孟博,崔名扬,刘力. (2019). 果蝇胚胎原位杂交实验方案. Bio-101 e1010246. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010246.
  2. Inagaki, S., Numata, K., Kondo, T., Tomita, M., Yasuda, K., Kanai, A. and Kageyama, Y. (2005). Identification and expression analysis of putative mRNA-like non-coding RNA in Drosophila. Genes Cells 10(12): 1163-1173.
  3. Li, M., Wen, S., Guo, X., Bai, B., Gong, Z., Liu, X., Wang, Y., Zhou, Y., Chen, X., Liu, L. and Chen, R. (2012). The novel long non-coding RNA CRG regulates Drosophila locomotor behavior. Nucleic Acids Res 40(22): 11714-11727.
  4. Li, M., Xu, M., Wen, S., Bai, B., Chen, R. and Liu, L. (2014). One novel long noncoding RNA lnc10 in Drosophila. J Genet Genomics 41(2): 79-82.
  5. Tautz, D. and Pfeifle, C. (1989). A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma 98(2): 81-85.
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引用格式:李美霞, 温省云, 许孟博, 崔名扬, 刘力. (2019). 果蝇成蝇脑原位杂交实验方案. Bio-101: e1010248. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010248.
How to cite: Li, M. X., Wen, S. Y., Xu, M. B., Cui, M. Y. and Liu, L. (2019). In situ Hybridization in Adult Drosophila Brain. Bio-101: e1010248. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010248.
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