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不同发育时期果蝇样品的收集
Collection of Drosophila Samples at Different Developmental Stages   

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摘要:果蝇发育主要有卵、幼虫、蛹和成虫几个发育阶段,主要讲述如何快速有效地收集这几个不同时期样本。

关键词: 果蝇, 发育时期, 样品收集

材料与试剂

  1. 1.5 ml离心管
  2. 博格利诺勾线笔
  3. Kimwipes纸巾 (Kimberly-Clark Worldwide, catalog number: 34155)
  4. 100 μm细胞滤网筛 (Corning Incorporated-Life Sciences, catalog number: 352360)
  5. 高糖型马利活性干酵母 (英联马利(北京)食品销售有限公司)
  6. 苹果汁
  7. 84消毒液
  8. PBS
  9. CO2
  10. 琼脂
  11. 食物平板 (见溶液配方)
  12. 酵母泥 (见溶液配方)
  13. 苹果汁板 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 果蝇培养瓶 (Genesee Scientific, catalog number: 32-130)
  2. 果蝇胚胎收集笼 (Genesee Scientific, catalog number: 59-101)
  3. 果蝇培养箱 (Percival Scientific, model: DR-41VL)
  4. 离心机 (Eppendorf)
  5. 微波炉

实验步骤

一、 果蝇卵的收集

  1. 果蝇培养条件:温度25 °C;湿度60%。准备4个果蝇培养瓶,每个培养瓶里各放50只雄果蝇和50只雌果蝇。
  2. 3天后,倒掉果蝇,每个培养瓶放一张kimwipes纸巾,增加蛹依附的空间,以收到更多的成虫。
  3. 第10天开始下一代成虫开始出,收集3天的成虫,并全部 (约1,200只果蝇) 集中放到果蝇胚胎收集笼中养2天,使用直径为10 cm的食物平板。为减少果蝇的损耗,把胚胎收集笼倒置,让食物平板在上,并放入2张kimwipes纸巾以保持环境干燥。
  4. 第3天更换新鲜的食物平板,并在食物平板上抹适量酵母,放入果蝇胚胎收集笼中适应一天,胚胎收集笼倒置,食物平板在上,更换2张新的kimwipes纸巾。
  5. 将苹果汁板上抹上酵母泥,苹果汁板在下面,每间隔1 h更换一次苹果汁板,换2~3次苹果汁板之后观察预产情况,卵数量足够即可开始收集。
  6. 用博格利诺勾线笔将苹果汁板上的卵收集到100 μm的细胞滤网筛中。
  7. 用自来水冲洗一遍。
    注:自来水的流速不能太大,并且避免直接冲洗卵,减少对卵的伤害。
  8. 用干纸巾吸干水分后,置于50% 84消毒液中漂洗1 min。
    注:50% 84消毒液处理的作用是去掉外层卵膜 (outer chorion)。
  9. 自来水冲洗1 min,注意水的流速不要太快。
  10. 洗干净的卵即可用于下一步实验。
    注:根据预期收集的胚胎发育时期,可以调整产卵笼下苹果汁板的更换间隙,并放置一定时间再收集胚胎。如:产卵笼下苹果汁板放置4小时使成虫产卵,取出后把平板在培养箱中放置12小时再收集,则得到的胚胎发育时期为12~16小时。

二、 果蝇幼虫、蛹及成虫的收集
  1. 准备3~5天的150只处女果蝇和200只雄果蝇,平均分到10个管里。
    注:食物上添加酵母,促进果蝇产卵,25 °C,60%湿度保证最佳培养条件。
  2. 每间隔4 h将果蝇转移至新的食物管中开始新的一轮实验计时,以4 h为一个时间段,收集对应时间段的幼虫。
  3. 24 h收第1龄的幼虫,48 h~72 h收第2龄的幼虫76 h~80 h收第3龄早期幼虫,96 h收第3龄中期幼虫,116 h收第3龄晚期幼虫,6天收早期的蛹,7天收中期的蛹,8天收晚期的蛹,9天收隐成虫,10天收成虫。每个时间点的果蝇参考下图1。


    图1. 不同发育时期果蝇形态 

  4. 收集不同时期的幼虫
    4.1
    搅碎食物,小心将幼虫转移到1.5 ml离心管中。
    4.2
    10,000 rpm室温离心5 min,幼虫会在上层,将其转移至干净的离心管中。
    4.3
    加入1 ml 1× PBS,10,000 rpm室温离心5 min,弃掉PBS。
    4.4
    如果是要做RNA相关实验,就可以加入Trizol进行处理。
    注:收集一龄幼虫也可以用收集胚胎的方法。洗净即可,不必用84消毒液处理。
  5. 收集不同时期的蛹
    5.1
    用博格利诺勾线笔小心将蛹夹出果蝇管,收集至1.5 ml离心管中。
    5.2
    10,000 rpm室温离心5 min,蛹会在上层,将其转移至干净的离心管中。
    5.3
    加入1 ml 1× PBS,10,000 rpm室温离心5 min,弃掉PBS。
    5.4
    如果是要做RNA相关实验,就可以加入Trizol进行处理。
  6. 收集成虫
    将果蝇用CO2麻醉后收集即可。

结果与分析

如果收到的卵不够或者很少,可以从两个方面是找原因:

  1. 果蝇是否都是3~7天的果蝇。
  2. 果蝇的密度一定要合适,太少肯定产卵少,太多果蝇状态很差,会粘死很多,也会导致卵少。

溶液配方

  1. 食物平板
    在10 cm平板中倒入1/2高度的果蝇食物,冷却即可
  2. 酵母泥
    5 g高糖型马利活性干酵母中加入8 ml双蒸水,搅拌混匀
  3. 苹果汁板
    1)
    200 ml双蒸水和100 ml的苹果汁混匀,加入6 g琼脂,摇匀
    2)
    微波炉加热至琼脂完全融化,倒入10 cm平板,冷却即可
    3)
    4 °C倒置保存
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Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:邓娟, 刘南. (2019). 不同发育时期果蝇样品的收集. Bio-101: e1010252. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010252.
How to cite: Deng, J and Liu, N. (2019). Collection of Drosophila Samples at Different Developmental Stages. Bio-101: e1010252. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010252.
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