不同发育时期果蝇样品的收集
Collection of Drosophila Samples at Different Developmental Stages   

材料与试剂

1. 1.5 ml离心管
2. 博格利诺勾线笔
3. Kimwipes纸巾 (Kimberly-Clark Worldwide, catalog number: 34155)
4. 100 μm细胞滤网筛 (Corning Incorporated-Life Sciences, catalog number: 352360)
5. 高糖型马利活性干酵母 (英联马利(北京)食品销售有限公司)
6. 苹果汁
7. 84消毒液
8. PBS
9. CO₂
10. 琼脂
11. 食物平板 (见溶液配方)
12. 酵母泥 (见溶液配方)
13. 苹果汁板 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 果蝇培养瓶 (Genesee Scientific, catalog number: 32-130)
2. 果蝇胚胎收集笼 (Genesee Scientific, catalog number: 59-101)
3. 果蝇培养箱 (Percival Scientific, model: DR-41VL)
4. 离心机 (Eppendorf)
5. 微波炉
   

实验步骤

一、果蝇卵的收集

1. 果蝇培养条件：温度25 °C；湿度60%。准备4个果蝇培养瓶，每个培养瓶里各放50只雄果蝇和50只雌果蝇。
2. 3天后，倒掉果蝇，每个培养瓶放一张kimwipes纸巾，增加蛹依附的空间，以收到更多的成虫。
3. 第10天开始下一代成虫开始出，收集3天的成虫，并全部 (约1,200只果蝇) 集中放到果蝇胚胎收集笼中养2天，使用直径为10 cm的食物平板。为减少果蝇的损耗，把胚胎收集笼倒置，让食物平板在上，并放入2张kimwipes纸巾以保持环境干燥。
4. 第3天更换新鲜的食物平板，并在食物平板上抹适量酵母，放入果蝇胚胎收集笼中适应一天，胚胎收集笼倒置，食物平板在上，更换2张新的kimwipes纸巾。
5. 将苹果汁板上抹上酵母泥，苹果汁板在下面，每间隔1 h更换一次苹果汁板，换2~3次苹果汁板之后观察预产情况，卵数量足够即可开始收集。
6. 用博格利诺勾线笔将苹果汁板上的卵收集到100 μm的细胞滤网筛中。
7. 用自来水冲洗一遍。
   注：自来水的流速不能太大，并且避免直接冲洗卵，减少对卵的伤害。
8. 用干纸巾吸干水分后，置于50% 84消毒液中漂洗1 min。
   注：50% 84消毒液处理的作用是去掉外层卵膜 (outer chorion)。
9. 自来水冲洗1 min，注意水的流速不要太快。
10. 洗干净的卵即可用于下一步实验。
    注：根据预期收集的胚胎发育时期，可以调整产卵笼下苹果汁板的更换间隙，并放置一定时间再收集胚胎。如：产卵笼下苹果汁板放置4小时使成虫产卵，取出后把平板在培养箱中放置12小时再收集，则得到的胚胎发育时期为12~16小时。

1. 准备3~5天的150只处女果蝇和200只雄果蝇，平均分到10个管里。
   注：食物上添加酵母，促进果蝇产卵，25 °C，60%湿度保证最佳培养条件。
2. 每间隔4 h将果蝇转移至新的食物管中开始新的一轮实验计时，以4 h为一个时间段，收集对应时间段的幼虫。
3. 24 h收第1龄的幼虫，48 h~72 h收第2龄的幼虫76 h~80 h收第3龄早期幼虫，96 h收第3龄中期幼虫，116 h收第3龄晚期幼虫，6天收早期的蛹，7天收中期的蛹，8天收晚期的蛹，9天收隐成虫，10天收成虫。每个时间点的果蝇参考下图1。
   
   
   图1. 不同发育时期果蝇形态 
   
   
4. 收集不同时期的幼虫
   
   4.1

   搅碎食物，小心将幼虫转移到1.5 ml离心管中。
   4.2

   10,000 rpm室温离心5 min，幼虫会在上层，将其转移至干净的离心管中。
   4.3

   加入1 ml 1× PBS，10,000 rpm室温离心5 min，弃掉PBS。
   4.4

   如果是要做RNA相关实验，就可以加入Trizol进行处理。
   注：收集一龄幼虫也可以用收集胚胎的方法。洗净即可，不必用84消毒液处理。
   
5. 收集不同时期的蛹
   
   5.1

   用博格利诺勾线笔小心将蛹夹出果蝇管，收集至1.5 ml离心管中。
   5.2

   10,000 rpm室温离心5 min，蛹会在上层，将其转移至干净的离心管中。
   5.3

   加入1 ml 1× PBS，10,000 rpm室温离心5 min，弃掉PBS。
   5.4

   如果是要做RNA相关实验，就可以加入Trizol进行处理。
6. 收集成虫
   将果蝇用CO₂麻醉后收集即可。

结果与分析

如果收到的卵不够或者很少，可以从两个方面是找原因：

1. 果蝇是否都是3~7天的果蝇。
2. 果蝇的密度一定要合适，太少肯定产卵少，太多果蝇状态很差，会粘死很多，也会导致卵少。

溶液配方

1. 食物平板
   在10 cm平板中倒入1/2高度的果蝇食物，冷却即可
2. 酵母泥
   5 g高糖型马利活性干酵母中加入8 ml双蒸水，搅拌混匀
3. 苹果汁板
   
   1)

   200 ml双蒸水和100 ml的苹果汁混匀，加入6 g琼脂，摇匀
   2)

   微波炉加热至琼脂完全融化，倒入10 cm平板，冷却即可
   3)

   4 °C倒置保存