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果蝇翅成虫盘RNA原位杂交技术
RNA in situ Hybridization in Drosophila Wing Imaginal Discs   

张延松张延松*刘敏刘敏*朱健朱健  (*对本文贡献相同)
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摘要:原位杂交 (in situ hybridization) 是指利用单链核酸分子之间互补碱基配对的原理,将带有标记的核酸探针与组织内核酸杂交成稳定的杂交双链核苷酸。经过显色反应,通过光学显微镜或电子显微镜可以对细胞内mRNA、tRNA和rRNA等RNA分子的存在与定位进行检查。原位杂交可以使用DNA或者RNA探针,本实验介绍使用RNA探针对果蝇翅成虫盘组织mRNA的原位杂交。

关键词: 果蝇, 翅成虫盘, 原位杂交

材料与试剂

  1.  移液枪头
  2. 1.5 ml塑料离心管 (Corning, AXYGEN, catalog number: MCT-150-C)
  3.  果蝇三龄幼虫
  4. VectorRed AP substrate Kit (Maravai LifeSciences, Vector Laboratories, SK-5100)
  5. NBT/BCIP (Thermo Fisher Scientific, catalog numbers: LA01, LA02)
  6. 抗地高辛碱性磷酸酶抗体 (Roche, catalog number: 11093274910)
  7. 抗地高辛辣根过氧化氢酶抗体 (Roche, catalog number: 1207733)
  8. PBS缓冲液 (Coolaber, catalog number: PM272215100)
  9. 吐温-20 (国药集团化学试剂有限公司,catalog number: 30189380)
  10. 甲酰胺 (VWR Life Science, AMRESCO, catalog number: 0314-500ML)
  11. 20× SSC (Solarbio, catalog number: S1035)
  12. 肝素 (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: S9276)
  13. 鲑鱼精子DNA (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: D1626)
  14. 氯化钠 (NaCl2, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: S7653)
  15. 六水合氯化镁 (MgCl2•6H2O, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: M2393)
  16. 左旋咪唑 (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: L9756)
  17. 三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液 (1 M Tris-HCl pH 8.8, Solarbio, catalog number: T1010)
  18. 4%多聚甲醛 (Paraformaldehyde, PFA) (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: 441244)
  19. 醋酸铵 (NH4OAc, Merck, Sigma-Aldrich, 631-61-8)
  20. 乙醇 (CH3CH2OH, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: E7148)
  21. 甲醇 (CH3OH, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: 67-56-1)
  22. DEPC (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: D5758)
  23. 转录缓冲液 (Transcription buffer, Roche, catalog number: 11465384001)
  24. 地高辛RNA标记混合液 (DIG RNA Labeling Mix, Roche, catalog number: 11277073910)
  25. T7 RNA聚合酶 (T7 RNA Polymerase, Roche, catalog number: 10881767001)
  26. SP6 RNA聚合酶 (SP6 RNA Polymerase, Roche, catalog number: 10810274001)
  27. RNA酶抑制剂 (RNAase inhibitor, Roche, catalog number: 3335399001)
  28. 碳酸钠 (Na2CO3, Merck, Sigma-Aldrich, 497-19-8)
  29. 碳酸氢钠 (Na2HCO3, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: Q0380)
  30. 醋酸钠 (NaOAc, Merck, Sigma-Aldrich, 6131-90-4)
  31. 氯化锂 (LiCl, Merck, Sigma-Aldrich, 7447-41-8)
  32. 转运RNA (tRNA, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: A5253-500G)
  33. PBSTw溶液 (见溶液配方)
  34. Hyb B (见溶液配方)
  35. Hyb A (见溶液配方)
  36. 碱性磷酸酶染色溶液 (见溶液配方)
  37. DEPC水 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 移液器 (Gilson, models: P2-P1000)
  2. -80 °C超低温冰箱 (Esco, Lexicon, model: UUS-668B-1)
  3. 4 °C及-20 °C冰箱 (Haier, model: BCD-539WT)
  4. 恒温水浴锅 (Thermo Fisher Scientific, model: ISOTEMP 202)
  5. 摇床 (杭州米欧,model: RH-24)
  6. 冷冻离心机 (Eppendorf, model: 5415D)
  7. 激光扫描共聚焦显微镜 (Leica, model: TCS SP8)
  8. 电子天平 (Mettler Toledo, model: PL602-S)

实验步骤

  1. RNA探针制备
    RNA探针一般设计为200 nt以上,探针浓度一般在500 μg/μl左右。用来合成RNA探针的模板DNA通过PCR方法制备,正义链5’端加SP6 RNA聚合酶结合序列,反义链5’端 (即模板DNA的3’端) 加T7 RNA聚合酶结合序列,以供转录。反义探针用于检测目标RNA,正义探针为阴性对照。
    1.1
    在1.5 ml塑料离心管中依次加入13 μl DNA 片段 (总量2 μg),2 μl转录缓冲溶液,2 μl地高辛RNA标记混合液,2 μl T7/SP6 RNA聚合酶 (T7反义探针,SP6正义探针),1 μl RNAase抑制剂。将离心管置于37 °C恒温金属浴孵育5~10 h。反应结束后,取1 μl反应产物进行DNA凝胶电泳,用于检测探针合成质量。
    1.2
    在离心管中加入30 μl DEPC水,25 μl 240 mM Na2CO3,25 μl 160 mM Na2HCO3,混合均匀置于60 °C恒温金属浴孵育10 min对探针进行碳酸化处理。
    1.3
    在离心管中依次加入100 μl 0.3 M NaOAc,20 μl 6 M LiCl,4 μl 50 μg/μl tRNA和600 μl乙醇。
    1.4
    将离心管置于-20 °C冰箱过夜用以沉淀RNA探针。
    1.5
    将离心管置于4 °C冷冻离心机以20,000 × g转速离心30 min。弃上清。
    1.6
    加入500 μl 70%乙醇/DEPC水,颠倒5~10次使RNA沉淀漂浮进行洗涤。将离心管置于4 °C冷冻离心机以20,000 × g转速离心30 min。弃上清。
    1.7
    晾干沉淀并加入100 μl DEPC水,将探针储存于-80 °C超低温冰箱。

  2. 组织原位杂交
    准备
    2.1
    在PBS缓冲液中解剖果蝇三龄幼虫,暴露翅成虫盘。具体流程请参照“果蝇翅成虫盘免疫荧光染色” (高远等,2019) 中组织解剖部分。将解剖完毕的果蝇组织置于1.5 ml离心管中。
    2.2
    (预固定处理) 在离心管中加入含4% PFA的PBS缓冲液 (固定剂),置于室温固定20 min。
    2.3
    去除固定剂,并加入500 μl的0.3 M NH4OAc溶液。再去除0.3 M NH4OAc溶液,并加入新的500 μl的0.3 M NH4OAc溶液。逐滴加入500 μl乙醇并轻轻颠倒混匀。
    2.4
    (脱水) 去除溶液后加入无水乙醇,在摇床上10 min以完全脱水,重复此步骤3次。此时组织可被储存于-20 °C。

    第一天
    2.5
    (脱水) 去除离心管中的乙醇,加入1 ml甲醇置于摇床上洗涤2 min,重复1次。
    2.6
    (再水化) 去除离心管中的甲醇,依次加入不同浓度的PBSTw (PBS缓冲液加入0.05%吐温-20)/甲醇混合溶液 (30% PBSTw/70%甲醇、50% PBSTw/50%甲醇、70% PBSTw/30%甲醇) 各洗涤2次,每次均置于摇床上洗涤2 min。
    2.7
    使用PBSTw溶液洗涤2次,每次均置于摇床上洗涤2 min。
    2.8
    (固定) 去除PBSTw溶液,加入含4% PFA的PBSTw溶液 (固定剂),置于摇床上固定20 min。
    2.9
    去除固定剂,使用PBSTw溶液中洗涤5次,每次均置于摇床上洗涤5 min,以彻底去除固定剂。预留一部分果蝇组织用以预处理抗地高辛碱性磷酸酶抗体(见步骤2.15)。
    2.10
    加入50% PBSTw/50% Hyb B溶液,置于摇床上洗涤5 min。
    2.11
    去除50% PBSTw/50% Hyb B溶液,加入Hyb B溶液中置于摇床上洗涤5 min。
    2.12
    (预杂交) 去除Hyb B溶液,加入150 μl Hyb A溶液,置于65 °C恒温金属浴孵育2 h。
    2.13
    在99 μl Hyb A溶液中加入1 μl探针,在80 °C恒温金属浴孵育5 min用以破坏探针可能存在的二级结构,并立即置于冰上10 min防止二级结构再生成。
    2.14
    去除65 °C孵育所用Hyb A溶液,并加入探针/Hyb A溶液,65 °C恒温金属浴孵育过夜使得探针与目的RNA进行杂交。
    2.15
    预处理抗地高辛碱性磷酸酶抗体(1:50溶于PBSTw溶液)用于第二天与探针的地高辛标记进行后续免疫显色反应。将抗体稀释液加入第2.9步预留的的果蝇组织,置于摇床上4 °C过夜。

    二天
    2.16
    去除探针/Hyb A溶液,使用500 μl Hyb B溶液65 °C恒温金属浴润洗7~12次,每次30 min。
    2.17
    去除Hyb B溶液,依次加入PBSTw (PBS溶液加入0.05%吐温)/Hyb B混合溶液 (30% PBSTw/70% Hyb B、50% PBSTw/50% Hyb B、70% PBSTw/30% Hyb B) 中各洗涤2次,每次均置于摇床上洗涤30 min。
    2.18
    使用PBSTw溶液洗涤5次,每次均置于摇床上洗涤5 min。
    2.19
    去除PBSTw溶液,加入150 μl预处理的抗地高辛碱性磷酸酶抗体与探针的地高辛标记反应 (将预处理的抗体1:40稀释于PBSTw溶液中,抗体终浓度为1:2,000),置于摇床上4 °C过夜。

    第三天
    2.20
    去除抗体稀释液,使用PBSTw溶液洗涤5次,每次均置于摇床上洗涤5 min。
    2.21
    去除PBSTw溶液,使用碱性磷酸酶染色溶液洗涤3次,每次均置于摇床上洗涤5 min。
    2.22
    加入碱性磷酸酶底物显色溶液 (5.85 μl NBT/3.3 μl BCIP),室温避光在摇床上孵育5~30 min。如使用红色荧光底物 (VectorRed AP substrate Kit),参见试剂盒说明书。
    2.23
    去除显色溶液,使用PBSTw溶液洗涤5次,每次均置于摇床上洗涤5 min。
    2.24
    将翅成虫盘置于甘油中制片,具体流程请参照“果蝇翅成虫盘免疫荧光染色” (高远等,2019) 中制片部分。

结果与分析

原位杂交结果示例 (图1):


图1. 原位杂交实验结果. w1118基因型果蝇翅成虫盘使用wg反义荧光探针(A) 和wg正义荧光探针 (B) 的VectorRed红色荧光底物显色。比例尺为100 μm。

注意事项

  1. 探针的质量
    探针质量是决定原位杂交结果的关键环节。我们一般会通过DNA凝胶电泳对探针质量进行检测。探针应检测到一条轻微弥散的RNA带,过于弥散或者没有条带则代表探针合成质量差 (图2)。


    图2. wg反义荧光探针的合成检测. 泳道左一,DNA Marker (上数第三条最亮条带为750bp)。泳道左二,wg反义荧光探针反应产物 (RNA探针制备步骤一)。

  2. 所有操作及溶液配制均应在没有RNA酶活性的情况下进行。
  3. 为保证较低的背景,用幼虫组织预处理抗体,以去除抗体中的杂质信号。
  4. DEPC剧毒,注意防止污染。

溶液配方

  1. PBSTw溶液
    PBS溶液中加入0.05%吐温-20
  2. Hyb B (20 ml)
    甲酰胺
    10 ml
    20× SSC (pH 5.0)
    5 ml
    PBS溶液
    5 ml
     -20 °C保存
  3. Hyb A (10 ml)
    甲酰胺
    5 ml
    20× SSC (pH 5.0)
    2.5 ml
    肝素 (5 mg/ml)
    100 μl
    10%吐温-20/PBS
    100 μl
    鲑鱼精子DNA (9.5 mg/ml)
    105 μl (终浓度100 μg/ml)
    加入PBS溶液至
    10 ml
     -20 °C保存
  4. 碱性磷酸酶染色溶液 (10 ml)
    5 M NaCl
    200 μl
    1 M Tris-Cl (pH 8.8)
    1 ml
    1 M MgCl2•6H2O
    500 μl
    10%吐温-20
    100 μl
    100 mM左旋咪唑
    100 μl
    加入DEPC水至
    10 ml
    现用现配
  5. DEPC水 (1 L)
    1 ml DEPC溶于1 L水中,常温过夜以除去水中RNA酶活性,高压灭菌

致谢

本实验室的工作得到细胞增殖与分化重点教育部重点实验室、膜生物学国家重点实验室、生命科学联合中心、国家自然科学基金和科学技术部的资金支持。本实验方案改编自本实验室的发表文章Du等 (2016)。

参考文献

  1. 高远,刘敏,朱健. (2019). 果蝇翅成虫盘免疫荧光染色. Bio-101 e1010260. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010260.
  2. Du, J., Zhang, J., He, T., Li, Y., Su, Y., Tie, F., Liu, M., Harte, P. J. and Zhu, A. J. (2016). Stuxnet facilitates the degradation of polycomb protein during development. Dev Cell 37(6): 507-519.
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Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:张延松, 刘敏, 朱健. (2019). 果蝇翅成虫盘RNA原位杂交技术. Bio-101: e1010261. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010261.
How to cite: Zhang, Y. S., Liu, M. and Zhu, A. J. (2019). RNA in situ Hybridization in Drosophila Wing Imaginal Discs. Bio-101: e1010261. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010261.
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