染色质免疫沉淀
Chromatin Immunoprecipitation   

材料与试剂

1. 移液枪头
2. 离心管
3. (可选) 过滤除菌器
4. 果蝇三龄幼虫
5. 多聚甲醛
6. 125 mM甘氨酸
7. RNase A
8. 蛋白酶K (20 mg/ml)
9. 琼脂糖珠子
10. PMSF
11. Protease Inhibitor Cocktail (Roche)
12. IgG (BioSS) 
13. 抗体 (根据实验需要)
14. PCR纯化试剂盒 (QIAGEN) 
15. (可选) 无水乙醇
16. LiCl
17. NP-40
18. Sodium deoxycholate
19. EDTA
20. Tris-HCl, pH 8.0
21. SDS
22. NaCl
23. Triton X-100
24. KCl
25. Na₂HPO₄
26. KH₂PO₄
27. RIPA裂解液 (见溶液配方)
28. RIPA缓冲液 (含350 mM NaCl) (见溶液配方)
29. 1× PBS缓冲液 (见溶液配方)
30. TEL缓冲液 (见溶液配方)
31. TE缓冲液 (见溶液配方)
32. 洗脱缓冲液 (见溶液配方)

仪器设备

1. 移液枪
2. 震荡仪
3. 超声破碎仪
4. 冷冻离心机
5. -80 °C冰箱
6. -20 °C冰箱
7. 旋转摇床
8. 金属浴锅
9. 高压蒸汽灭菌
   

实验步骤

本实验流程如下：

1. 样品制备
   
   1.1

   在预冷的磷酸盐缓冲液PBS (含有1 mM PMSF和Protease Inhibitor Cocktail, Roche) 中解剖50只果蝇三龄幼虫的脂肪体。
   1.2

   把解剖好的脂肪体放入装有200 μl预冷的PBS (含有1 mM PMSF和Protease Inhibitor Cocktail, Roche) 的1.5 ml的离心管中，并加入多聚甲醛使其终浓度为1%，37 °C交联15分钟。交联期间每5分钟用振荡仪振荡一下。
   1.3

   加入终浓度为125 mM甘氨酸，室温孵育2分钟终止交联反应。
   1.4

   终止反应后，用预冷的PBS (含有1 mM PMSF和Protease Inhibitor Cocktail, Roche) 洗2次。
   1.5

   加入350 μl的RIPA裂解液并充分匀浆，然后用超声破碎仪将染色质打断成为200~1,000 bp的片段。超声条件因仪器的不同而不同。如使用Ultrasonic Homogenizer 4710 series (Cole-Parmer Instrument Co. Chicago, USA), 超声条件为：Duty Cycle 30%, Output Control 2, 超声时间10秒，间隔时间1分钟，超声次数12次。这一步是该实验的关键步骤，超声片段过大会严重降低共沉淀效率，而片段过小会导致PCR难以检测。
   1.6

   超声后的样品，4 °C条件下，15,000 × g离心15分钟，去除细胞碎片和脂类物质。
   1.7

   离心后，留上清进行下一步染色质免疫沉淀实验，或者冻于-80 °C备用。
2. 染色质免疫沉淀
   2.1

   从制备好的样品中取10%作为Input，-20 °C储存。其余样品平均分成两份，分别加入等量的IgG (BioSS) 和相应抗体，4 °C旋转摇床孵育过夜。
   2.2

   取被Salmon Sperm DNA封闭的protein A或者protein G的珠子各20 μl，用RIPA裂解液洗三次。
   2.3

   把与抗体或者IgG孵育过夜的样品加入预处理完的珠子中，4 °C孵育2小时。800 × g离心2分钟，去除上清。
   2.4

   依次用1 ml下列缓冲液清洗琼脂糖珠子：RIPA缓冲液洗2次，每次5分钟；RIPA缓冲液 (含350 mM NaCl) 洗2次，5分钟；TEL缓冲液 (溶液配方1) 洗2次，每次5分钟；TE缓冲液 (溶液配方2) 洗2次，每次5分钟。
   2.5

   加入150 μl洗脱缓冲液 (溶液配方3)，65 °C金属浴15分钟，期间每5分钟振荡一次。800 × g离心2分钟，吸取上清至新的EP管。再加入150 μl洗脱缓冲液重复处理一次，将两次得到的上清合并。
   2.6

   把洗脱得到的DNA样品中加入1 μl RNase A (10 mg/ml)，之前留下来的input DNA样品中加入4 μl RNase A (10 mg/ml)，室温处理2小时。
   2.7

   把洗脱得到的DNA样品中加入1 μl蛋白酶K (20 mg/ml)，之前留下来的input DNA样品中加入2.5 μl蛋白酶K，55 °C金属浴处理2小时。65 °C金属浴处理过夜解交联。
   2.8

   解交联之后的DNA样品通过PCR纯化试剂盒 (QIAGEN) 或者无水乙醇沉淀回收，用于荧光定量PCR检测。纯化后的Input DNA 1:50稀释后，作为定量PCR检测的模板。

溶液配方

1. RIPA裂解液 (不含抑制剂)
   50 mM Tris-HCl, pH 7.4
   1 mM EDTA
   0.1% sodium deoxycholate
   0.1% SDS
   150 mM NaCl
   1% Triton X-100
2. RIPA缓冲液 (含350 mM NaCl但不含抑制剂)
   50 mM Tris-HCl, pH 7.4
   1 mM EDTA
   0.1% sodium deoxycholate
   0.1% SDS
   350 mM NaCl
   1% Triton X-100
3. 1× PBS缓冲液
   137 mmol/L NaCl
   2.7 mmol/L KCl
   10 mmol/L Na₂HPO₄
   2 mmol/L KH₂PO₄
   用800 ml蒸馏水溶解8 g NaCl，0.2 g KCl, 1.44 g Na₂PHO₄,和0.24 g KH₂PO₄。用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1 L。分装后在15 psi (1.05 kg/cm²) 高压蒸汽灭菌20 min，或过滤除菌，室温保存
4. TEL缓冲液
   0.25 M LiCl
   1% NP-40
   1% sodium deoxycholate
   1 mM EDTA
   10 mM Tris-HCl, pH 8.0
5. TE缓冲液
   10 mM Tris-HCl, pH 8.0
   1 mM EDTA
6. 洗脱缓冲液
   10 mM Tris-HCl, pH 8.0
   1 mM EDTA
   1% SDS
   250 mM NaCl
   

参考文献

1. Yao, Y., Li, X., Wang, W., Liu, Z., Chen, J., Ding, M. and Huang, X. (2018). MRT, functioning with NURF complex, regulates lipid droplet size. Cell Rep 24(11): 2972-2984.