全细胞记录成年果蝇大脑l-LNv细胞
Whole Cell Recordings of l-LNv Cells in Adult Drosophila Brain   

材料与试剂

一、果蝇品系

1. PDF-Gal4/+; UAS-mCD8-GFP/+
   注：PDF-Gal4/+; UAS-mCD8-GFP/+由pdf-Gal4与UAS-mCD8::GFP杂交得到。
2. pdf-Gal4 (Bloomington Stock Center，BL-6900，此株pdf-GAL4位于2号染色体)
3. UAS-mCD8::GFP (Bloomington Stock Center，BL-5130，此株UAS-mCD8::GFP位于3号染色体)
   
   

二、体外离体解剖

1. 1× PBS (Sangon Biotech, catalog number: E607008)
2. 木瓜蛋白酶悬浮液 (Diamond, catalog number: A003124)
3. L-半胱氨酸 (BBI Life Science, catalog number: CB0132)
   
   

三、电生理试剂

1. 氯化钠 (NaCl) (Sigma-Aldrich, catalog number: 746398)
2. 氯化钾 (KCl) (Sigma-Aldrich, catalog number: P4504)
3. 二水氯化钙 (CaCl₂·2H₂O) (Sangon Biotech, catalog number: C0556)
4. 六水氯化镁 (MgCl₂·6H₂O) (Sangon Biotech, catalog number: C0288)
5. TES (Sigma-Aldrich, catalog number: T1375)
6. 葡萄糖 (Glucose) (Sigma-Aldrich, catalog number: G8270)
7. 海藻糖 (Trehalose) (BBI Life Science, catalog number: TB0919)
8. 蔗糖 (Sucrose) (Sigma-Aldrich, catalog number: S1888)
9. 碳酸氢钠 (NaHCO₃) (Sigma-Aldrich, catalog number: S5761)
10. 磷酸二氢钠 (NaH₂PO₄) (Sangon Biotech, catalog number: S0571)
11. HEPES (Sigma-Aldrich, catalog number: H3375)
12. 葡萄糖酸钾 (K-gluconate) (Sigma-Aldrich, catalog number: G4500)
13. EGTA (Sangon Biotech, catalog number: E0732)
14. Mg-ATP (Sigma-Aldrich, catalog number: A9187)
15. Na₃GTP (Sigma-Aldrich, catalog number: G8877)
16. 组织消化液 (见溶液配方)
17. 细胞外液与电极内液 (见溶液配方)

仪器设备

1. 水平拉制仪 (Sutter Instrument, model: P-97)
2. 玻璃毛细管 (Sutter Instrument, model: BF120-69-15)
3. 光照培养箱 (宁波海曙赛福实验仪器厂)
4. 显微解剖台 (尼康)
5. 生物专用直头镊子 (中镜科仪，model：EP525)
6. 直立显微镜 (Olympus, model: X51)
7. 微操纵器 (Sutter Instrument, model: SD-MX760)
8. 放大器 (Molecular Devices, model: Axopatch200B)
9. 数字化仪 (Molecular Devices, model: Digidata 1320A)
10. 空气台和法拉第笼 (Sutter Instrument, model: AT-3036)
11. 蠕动泵系统 (Cole-Parmer, catalog number: EW-77910-20)
12. 记录槽
13. 铂金丝网
14. 汞灯
    

软件

1. pClamp软件套件 (最低版本8.2)：Minianalysis program (Synaptosoft) 软件

实验步骤

1. 果蝇预处理
   挑选2~3日龄的雌性果蝇，将其放置于12小时光照/12小时黑暗的培养箱中饲养两天，再转入持续黑暗的培养箱中饲养两天，在CT2-CT4 (CT0代表开灯时刻，CT2-4相当于开灯2 h~4 h之间)时取果蝇进行实验
2. 微电极的制备
   将玻璃毛细管放置在P-97水平拉制仪上采用四步法将其拉成记录用的微电极。本实验旨在记录l-LNvs神经元的电活动，由于其胞体直径只有5~8 µm，所以电极尖端必须严格控制在2.5 µm以下，灌注电极内液后电极阻抗为3.5~4 MΩ。
3. 细胞外液预处理
   实验前预先向细胞外液充入95% O₂/5% CO₂的混合气体，并循环灌流。
4. 组织解剖
   将果蝇放入大脑解剖溶液中，在显微镜下用镊子使果蝇头部和身体分离，保留头部，小心去除头部的表皮并保持其眼睛和大脑的完整性，此步骤需要在3分钟内完成 (视频链接：http://video.tudou.com/v/XMjIyOTM5MjI1Ng==.html?__fr=oldtd)。
5. 组织消化
   将果蝇大脑迅速转移到细胞消化液中，37 °C水浴处理8 min，充分暴露PDF⁺细胞，消化充分的PDF⁺细胞一般胞体饱满均匀，边界清楚。
6. 组织转移与固定
   将消化处理后的组织转移到记录槽中，正面朝上，用铂金丝网压在大脑中央，置于Olympus X51显微镜视野正中 (图1A和1B)。
7. 定位目标l-LNv细胞 (图1)
   打开汞灯，在40倍物镜下，寻找绿色荧光蛋白标记的PDF+细胞。(PDF+细胞是一组位于果蝇头部腹外侧的神经核团 (LNVs)，包含8个Large-LNVs和8个small-LNVs细胞，Large-LNVs体积比small-LNVs大)
   
   
   图1. 显微镜视野下1-LNvs神经元胞体. A. 光学显微镜下1-LNvs神经元胞体，目镜40×，荧光显微镜下1-LNvs神经元胞体，目镜40×。
   
   
8. 全细胞记录
   在电压钳模式下用SD-MX760微操纵器控制充有电极内液的玻璃微电极靠近细胞，待电极尖端进入外液前，轻轻将注射器向前推1/10的体积在电极内给一个正压，正压大小约为神经元1/5，最终尖端电阻为9~10 Ω。待电极靠近Large-LNvs细胞后 (表现为胞体附近组织明显被电极吹开，还能观察到电极阻抗上升现象)，释放掉正压并顺势用嘴给一个负压，同时holding电压调节到-50 mV形成高阻封接 (> 1 GΩ)。再慢慢将钳电压调到-70 mV。待封接稳定形成之后，给予大而短促的负压可以使电极尖端下的局部细胞膜破裂，从而形成全细胞记录模式 (Whole-cell recording)。
9. 对Large-LNVs记录模式采用电流钳式，即神经元自发放电在电流为零 (I = 0) 时的放电频率，记录细胞在这一过程中的自发放电情况。
10. 实验结果通过Minianalysis program (Synaptosoft) 软件分析。
    

失败经验

1. 若组织解剖时间过久，会出现细胞状态变差，在显微镜下可以观察到清晰的细胞核结构，细胞不够饱满，此时不能够记录到动作电位。
2. 若组织消化时间不够或过久都会导致实验失败，当组织消化不够充分时，目标细胞不能完全暴露出来，一方面周围的胶质细胞会阻止电极尖端到达目标细胞，另一方面即使能够接触到目标细胞但是也不能够将目标细胞吸破，导致记录不到细胞内的电位变化。若组织消化时间过久，会导致细胞状态变差，此时记录到细胞的静息电位为正。因此，对于木瓜蛋白酶的浓度及组织消化时间都要提前试好条件。
3. 细胞外液要现用现配，不易放置过久时间。
   

溶液配方

1. 组织消化液
   50 U/ml木瓜蛋白酶、1 mM L-半胱氨酸，溶于1× PBS溶液中
   注：溶液需要现配，配制完成后37 °C活化10 min后放置于冰上待用
2. 细胞外液与电极内液
   
   注：细胞外液需实验当天配制，电极内液可配好后分装成0.5~1 ml/管，放置于-20 °C保存待用。
   

致谢

感谢东南大学生命科学研究院刘安博士提供电生理技术支持。感谢国家自然科学基金项目 (31471031) 的支持。

参考文献

1. Li, Y., Zhou, Z., Zhang, X., Tong, H., Li, P., Zhang, Z. C., Jia, Z., Xie, W. and Han, J. (2013). Drosophila neuroligin 4 regulates sleep through modulating GABA transmission. J Neurosci 33(39): 15545-15554.
2. Li, Q., Li, Y., Wang, X., Qi, J., Jin, X., Tong, H., Zhou, Z., Zhang, Z. C. and Han, J. (2017). Fbxl4 serves as a clock output molecule that regulates sleep through promotion of rhythmic degradation of the GABAA receptor. Curr Biol 27(23): 3616-3625 e3615.
3. Roemmich, A. J., Schutte, S. S. and O'Dowd, D. K. (2018). Ex vivo whole-cell recordings in adult Drosophila brain. Bio-protocol 8(14): e2467.