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全细胞记录成年果蝇大脑l-LNv细胞
Whole Cell Recordings of l-LNv Cells in Adult Drosophila Brain   

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摘要:电生理技术是指以多种形式的能量 (电、声等) 刺激生物体,记录和分析生物体发生的生物电现象和电特性的技术。本文中,我们使用全脑解剖和全细胞记录的方法来表征成年果蝇l-LNv神经元的电学特性,揭示调控生物节律和睡眠行为的细胞机制。

关键词: 电生理, 成年果蝇, l-LNv

材料与试剂

一、果蝇品系

  1. PDF-Gal4/+; UAS-mCD8-GFP/+
    注:PDF-Gal4/+; UAS-mCD8-GFP/+由pdf-Gal4与UAS-mCD8::GFP杂交得到。
  2. pdf-Gal4 (Bloomington Stock Center,BL-6900,此株pdf-GAL4位于2号染色体)
  3. UAS-mCD8::GFP (Bloomington Stock Center,BL-5130,此株UAS-mCD8::GFP位于3号染色体)

二、体外离体解剖

  1. 1× PBS (Sangon Biotech, catalog number: E607008)
  2. 木瓜蛋白酶悬浮液 (Diamond, catalog number: A003124)
  3. L-半胱氨酸 (BBI Life Science, catalog number: CB0132)

三、电生理试剂

  1. 氯化钠 (NaCl) (Sigma-Aldrich, catalog number: 746398)
  2. 氯化钾 (KCl) (Sigma-Aldrich, catalog number: P4504)
  3. 二水氯化钙 (CaCl2·2H2O) (Sangon Biotech, catalog number: C0556)
  4. 六水氯化镁 (MgCl2·6H2O) (Sangon Biotech, catalog number: C0288)
  5. TES (Sigma-Aldrich, catalog number: T1375)
  6. 葡萄糖 (Glucose) (Sigma-Aldrich, catalog number: G8270)
  7. 海藻糖 (Trehalose) (BBI Life Science, catalog number: TB0919)
  8. 蔗糖 (Sucrose) (Sigma-Aldrich, catalog number: S1888)
  9. 碳酸氢钠 (NaHCO3) (Sigma-Aldrich, catalog number: S5761)
  10. 磷酸二氢钠 (NaH2PO4) (Sangon Biotech, catalog number: S0571)
  11. HEPES (Sigma-Aldrich, catalog number: H3375)
  12. 葡萄糖酸钾 (K-gluconate) (Sigma-Aldrich, catalog number: G4500)
  13. EGTA (Sangon Biotech, catalog number: E0732)
  14. Mg-ATP (Sigma-Aldrich, catalog number: A9187)
  15. Na3GTP (Sigma-Aldrich, catalog number: G8877)
  16. 组织消化液 (见溶液配方)
  17. 细胞外液与电极内液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 水平拉制仪 (Sutter Instrument, model: P-97)
  2. 玻璃毛细管 (Sutter Instrument, model: BF120-69-15)
  3. 光照培养箱 (宁波海曙赛福实验仪器厂)
  4. 显微解剖台 (尼康)
  5. 生物专用直头镊子 (中镜科仪,model:EP525)
  6. 直立显微镜 (Olympus, model: X51)
  7. 微操纵器 (Sutter Instrument, model: SD-MX760)
  8. 放大器 (Molecular Devices, model: Axopatch200B)
  9. 数字化仪 (Molecular Devices, model: Digidata 1320A)
  10. 空气台和法拉第笼 (Sutter Instrument, model: AT-3036)
  11. 蠕动泵系统 (Cole-Parmer, catalog number: EW-77910-20)
  12. 记录槽
  13. 铂金丝网
  14. 汞灯

软件

  1. pClamp软件套件 (最低版本8.2):Minianalysis program (Synaptosoft) 软件

实验步骤

  1. 果蝇预处理
    挑选2~3日龄的雌性果蝇,将其放置于12小时光照/12小时黑暗的培养箱中饲养两天,再转入持续黑暗的培养箱中饲养两天,在CT2-CT4 (CT0代表开灯时刻,CT2-4相当于开灯2 h~4 h之间)时取果蝇进行实验
  2. 微电极的制备
    将玻璃毛细管放置在P-97水平拉制仪上采用四步法将其拉成记录用的微电极。本实验旨在记录l-LNvs神经元的电活动,由于其胞体直径只有5~8 µm,所以电极尖端必须严格控制在2.5 µm以下,灌注电极内液后电极阻抗为3.5~4 MΩ。
  3. 细胞外液预处理
    实验前预先向细胞外液充入95% O2/5% CO2的混合气体,并循环灌流。
  4. 组织解剖
    将果蝇放入大脑解剖溶液中,在显微镜下用镊子使果蝇头部和身体分离,保留头部,小心去除头部的表皮并保持其眼睛和大脑的完整性,此步骤需要在3分钟内完成 (视频链接:http://video.tudou.com/v/XMjIyOTM5MjI1Ng==.html?__fr=oldtd)。
  5. 组织消化
    将果蝇大脑迅速转移到细胞消化液中,37 °C水浴处理8 min,充分暴露PDF+细胞,消化充分的PDF+细胞一般胞体饱满均匀,边界清楚。
  6. 组织转移与固定
    将消化处理后的组织转移到记录槽中,正面朝上,用铂金丝网压在大脑中央,置于Olympus X51显微镜视野正中 (图1A和1B)。
  7. 定位目标l-LNv细胞 (图1)
    打开汞灯,在40倍物镜下,寻找绿色荧光蛋白标记的PDF+细胞。(PDF+细胞是一组位于果蝇头部腹外侧的神经核团 (LNVs),包含8个Large-LNVs和8个small-LNVs细胞,Large-LNVs体积比small-LNVs大)


    图1. 显微镜视野下1-LNvs神经元胞体. A. 光学显微镜下1-LNvs神经元胞体,目镜40×,荧光显微镜下1-LNvs神经元胞体,目镜40×。

  8. 全细胞记录
    在电压钳模式下用SD-MX760微操纵器控制充有电极内液的玻璃微电极靠近细胞,待电极尖端进入外液前,轻轻将注射器向前推1/10的体积在电极内给一个正压,正压大小约为神经元1/5,最终尖端电阻为9~10 Ω。待电极靠近Large-LNvs细胞后 (表现为胞体附近组织明显被电极吹开,还能观察到电极阻抗上升现象),释放掉正压并顺势用嘴给一个负压,同时holding电压调节到-50 mV形成高阻封接 (> 1 GΩ)。再慢慢将钳电压调到-70 mV。待封接稳定形成之后,给予大而短促的负压可以使电极尖端下的局部细胞膜破裂,从而形成全细胞记录模式 (Whole-cell recording)。
  9. 对Large-LNVs记录模式采用电流钳式,即神经元自发放电在电流为零 (I = 0) 时的放电频率,记录细胞在这一过程中的自发放电情况。
  10. 实验结果通过Minianalysis program (Synaptosoft) 软件分析。

失败经验

  1. 若组织解剖时间过久,会出现细胞状态变差,在显微镜下可以观察到清晰的细胞核结构,细胞不够饱满,此时不能够记录到动作电位。
  2. 若组织消化时间不够或过久都会导致实验失败,当组织消化不够充分时,目标细胞不能完全暴露出来,一方面周围的胶质细胞会阻止电极尖端到达目标细胞,另一方面即使能够接触到目标细胞但是也不能够将目标细胞吸破,导致记录不到细胞内的电位变化。若组织消化时间过久,会导致细胞状态变差,此时记录到细胞的静息电位为正。因此,对于木瓜蛋白酶的浓度及组织消化时间都要提前试好条件。
  3. 细胞外液要现用现配,不易放置过久时间。

溶液配方

  1. 组织消化液
    50 U/ml木瓜蛋白酶、1 mM L-半胱氨酸,溶于1× PBS溶液中
    注:溶液需要现配,配制完成后37 °C活化10 min后放置于冰上待用
  2. 细胞外液与电极内液

    注:细胞外液需实验当天配制,电极内液可配好后分装成0.5~1 ml/管,放置于-20 °C保存待用。

致谢

感谢东南大学生命科学研究院刘安博士提供电生理技术支持。感谢国家自然科学基金项目 (31471031) 的支持。

参考文献

  1. Li, Y., Zhou, Z., Zhang, X., Tong, H., Li, P., Zhang, Z. C., Jia, Z., Xie, W. and Han, J. (2013). Drosophila neuroligin 4 regulates sleep through modulating GABA transmission. J Neurosci 33(39): 15545-15554.
  2. Li, Q., Li, Y., Wang, X., Qi, J., Jin, X., Tong, H., Zhou, Z., Zhang, Z. C. and Han, J. (2017). Fbxl4 serves as a clock output molecule that regulates sleep through promotion of rhythmic degradation of the GABAA receptor. Curr Biol 27(23): 3616-3625 e3615.
  3. Roemmich, A. J., Schutte, S. S. and O'Dowd, D. K. (2018). Ex vivo whole-cell recordings in adult Drosophila brain. Bio-protocol 8(14): e2467.
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Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王婷婷, 李倩, 韩俊海. (2019). 全细胞记录成年果蝇大脑l-LNv细胞. Bio-101: e1010286. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010286.
How to cite: Wang, T. T., Li, Q. and Han, J. H. (2019). Whole Cell Recordings of l-LNv Cells in Adult Drosophila Brain. Bio-101: e1010286. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010286.
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