影响系统发育分析的昆虫共生菌Wolbachia筛查及分型方法
Screening and Typing of Symbiotic Wolbachia that Affects Insect Phylogenetic Analysis   

研究背景

线粒体DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA) 是动物体内唯一存在于核外的遗传信息载体，共价闭合的环状分子，结构简单，进化速率快，母系遗传（但有少量双亲遗传的案例已被证实），是研究低级分类单元较好的分子标记，已被广泛应用于多种动物类群的种群遗传结构、物种鉴定和系统发育等研究 (Gray et al., 1999)。然而，采用mtDNA对一些昆虫进行相关调查的结果却不能正确反映其遗传多样性和物种分类等信息。研究显示，原因可能与一类胞内共生菌Wolbachia Hertig, 1936有关 (Gerth et al., 2011)。
        Wolbachia隶属于α-变形菌纲Alphaproteobacteria，立克次氏体目Rickettsiales、无形体科Anaplasmataceae，是一类广泛存在于节肢动物和线虫生殖组织中，可调控寄主生殖行为的细胞内共生菌 (Riegler and O'Neill, 2006)。据统计学分析，Wolbachia能感染全球约2/3的昆虫物种，是昆虫中分布最广泛的共生菌 (Hilgenboecker et al., 2008)。在细胞中，Wolbachia 和寄主mtDNA都以母系遗传方式传递给后代，Wolbachia能在种群和物种的水平上影响寄主mtDNA的遗传多样性 (Whitworth et al., 2007)。在种群水平上，研究发现Wolbachia的侵染可能会产生"选择性清扫" (selective sweep) 作用，即Wolbachia依赖自身的选择优势在寄主种群内迅速扩散，与其相关联的mtDNA类型在种群中的比例也随之扩大，降低了寄主种群mtDNA多态性水平，从而干扰了mtDNA作为分子标记研究种群遗传结构的分析结果 (Jackel et al., 2013)。在物种水平上，由于同域分布的近缘种间往往存在杂交现象，Wolbachia的感染和传播所产生的"选择性清扫"作用，则可能导致近缘种之间产生mtDNA的渐渗现象 (introgression)，使得核基因水平上关系非接近的种类却具有非常相似的mtDNA单倍型和Wolbachia株型 (Whitworth et al., 2007)。
        本文提供了详细的昆虫共生菌Wolbachia筛查及分型方法，有助于分子系统学实验室在短时间内掌握。该方案的有效性已在鳞翅目分子系统学研究中得以验证，详细结果请参阅 Jiang et al., 2018。

材料与试剂

1.  无菌无酶 EP 管 (1.5 ml，Axygen Scientific公司，Axygen)
2.  无菌无酶移液器吸头 (20 μl、200 μl 和 1000 μl，Axygen Scientific 公司，Axygen)
3.  一次性橡胶手套
4. DNA提取试剂盒 (QIAGEN 公司，Qiagen，catalog number: 51304)
5. 无水乙醇 (上海国药)
6. TE 缓冲液 (生工生物工程 (上海) 股份有限公司，生工，catalog number: B548106-0500)
7. Taq PCR Master Mix (上海天根)
8. 琼脂糖 (上海天根)
9. Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒 (上海生工，catalog number: SK8132)
10. 核酸染料 (O.P.D)
11. DNA Marker (上海天根)
12. 蛋白酶K (上海天根)
    

仪器设备

1. 无菌剪刀、镊子
2. 移液器 (Eppendorf)
3. 电动研磨仪(天根生化)
4. PCR仪 (Eppendorf)
5. 电泳仪 (上海天能)
6. 凝胶成像系统 (上海天能)
7. 超低温冰箱 (青岛海尔)
8. -20 °C冰箱 (青岛海尔)
9. 小型离心机 (Eppendorf)
10. 恒温水浴锅 (精宏)
11. 高压灭菌锅 (Kagoshima Seisakusyo Inc.)
12. 电子天平 (上海精密)
13. 微波炉 (格兰仕)
14. 纯水仪 (Millipore)
    

实验步骤

一、总DNA提取
使用QIAamp DNA Mini kit试剂盒进行样本DNA提取，按照制造商的说明，从昆虫宿主的整个腹部 (腿部) 中进行总DNA的提取。具体操作步骤如下：

1. 用小手术剪将实验样品孔弄蝶的2-3条足剪切成尽量小的碎片，使用电动研磨仪进行研磨后，转移至1.5 ml离心管中。
2. 加入230 µl Buffer ATL和20 µl蛋白酶 K，涡旋混匀。56 °C温浴1-3 h或过夜，期间需颠倒混匀几次。
3. 加入10 µl的RNase Solution (50 mg/ml)至上一步得到的消化液中，颠倒混匀，室温或37 °C放置15-60 min。
4. 在12,000 × g条件下离心3 min，转移上清液至新的1.5 ml离心管中。
5. 加入250 µl的Buffer DL至消化液中，最高速度涡旋20 s，70 °C水浴10 min。
6. 加入250 µl的无水乙醇至消化液中，涡旋混匀20 s。
7. 将HiPure gDNA Mini Column装在2 ml的收集管中，转移第6步获得的混合液 (包括沉淀) 至柱子中，然后在12,000 × g离心1 min。
8. 倒弃滤液，把柱子装回收集管中。然后加入500 µl Buffer GW1至柱子中。12,000 × g离心1 min。
9. 倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入650 µl Buffer GW2至柱子中。12,000 × g离心1 min。重复两次。
10. 倒弃滤液，把柱子装回收集管中。12,000 × g离心2 min。
11. 将柱子装在新的1.5 ml离心管中。加30 µl蒸馏水，放置3 min，12,000 × g离心1 min。
12. 再加30 µl蒸馏水至柱子的膜中央。放置3 min，然后在12,000 × g条件下离心1 min。
13. 弃去DNA结合柱。把DNA保存于4 °C的冰箱中，长期保存则放置于-20 °C条件下。
    

二、Wolbachia菌的筛查与分型

1. Wolbachia菌的特异性基因引物的PCR检测
   实验采用25 µl的PCR扩增反应体系，具体组份如下。
   
   表1. 25 µl PCR反应体系
   

   组份	体积
   2x TapPCR. Master Mix	12.5 µl
   H2O	9.5 µl
   Primer F (1 μM)	1.0 µl
   Primer R (1 μM)	1.0 µl
   模板DNA	1.0 µl

   
   
2. Wolbachia菌基因引物
   经试剂盒提取出的总DNA包含了宿主自身的基因，同时也含有可能感染的Wolbachia菌的DNA及外界杂质的DNA等，因此需要使用相应的引物对不同的目的基因进行PCR扩增。为了筛选出感染Wolbachia菌的个体，按照Zhou et al. (1998) 已发表的方案利用Wolbachia的wsp基因特异引物，引物信息见表2。在检测的样本中，挑选出阳性个体，在剩余的阴性个体中重复目的基因wsp的扩增，筛选出所有的阳性个体。根据Wolbachia菌MLST数据库 (https://pubmlst.org/organisms/wolbachia-spp) 中推荐的多个基因座进行测序，对Wolbachia菌菌株进行表征 (Baldo et al., 2006)。多基因扩增所需扩增5个基因 (gatB、hcpA、ftsZ、coxA、fbpA)，引物信息见表2。
   
   表2. 扩增引物的具体相关信息
   

   目的基因	引物名称	序列 (5'→3')	参考文献
   wsp	wsp _81F wsp _691R	TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA	Zhou et al., 1998
   gatB	gatB_F1 gatB_R1	GAK TTA AAY CGY GCA GGB GTT TGG YAA YTC RGG YAA AGA TGA	Baldo et al., 2006
   coxA	coxA_F1 coxA_R1	TTG GRG CRA TYA ACT TTA TAG TCT AAA GAC TTT KAC RCC AGT	Baldo et al., 2006
   hcpA	hcpA _F1 hcpA _R1	GAA ATA RCA GTT GCT GCA AA GAA AGT YRA GCA AGY TCT G	Baldo et al., 2006
   ftsZ	ftsZ_F1 ftsZ_R1	ATY ATG GAR CAT ATA AAR GAT AG TCR AGY AAT GGA TTR GAT AT	Baldo et al., 2006
   fbpA	fbpA_F1 fbpA_R1	GCT GCT CCR CTT GGY WTG AT CCR CCA GAR AAA AYY ACT ATT C	Baldo et al., 2006

   
   扩增各目的片段的具体PCR反应程序如下：
   wsp的PCR反应程序：
   

   循环阶段	温度	时间	循环数
   预变性	94 °C	2 min	1
   变性	94 °C	30 s
   退火	55 °C	45 s	37
   延伸	72 °C	90 s
   最终延伸	72 °C	10 min	1
   保存	4 °C	∞

   
   MLST的PCR反应程序：
   

   循环阶段	温度	时间	循环数
   预变性	94 °C	2 min	1
   变性	94 °C	30 s
   退火	55 °C	45 s	37
   延伸	72 °C	90 s
   最终延伸	72 °C	10 min	1
   保存	4 °C	∞

   
   

3. PCR扩增产物检测
   为了检验是否扩增出目的片段，利用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，具体过程如下：
   3.1称量1.2 g琼脂糖溶于60 ml 1x TAE中，置于微波炉中加热至完全溶解，冷却后加入1 μl gel-red核酸染色剂，配制成浓度为2%的琼脂糖凝胶。
   3.2取5 μl的PCR扩增产物，加入上样孔中。
   3.3取5 μl DL1000 Marker加入上样孔中。
   3.4110 V恒压下电泳30 min。
   3.5利用凝胶成像系统，观察电泳结果。
   
4. 目的片段的纯化回收
   经过琼脂糖凝胶电泳分离出目的片段后，将凝胶块转移到蓝光切胶仪上，尽快切下含目的片段的胶块，回收目的片段，具体操作步骤如下：
   4.1从琼脂糖凝胶中切割下尽量小的含目标片段的胶块并称重。
   4.2将切割下的胶块置于1.5 ml的离心管中，向离心管中加入胶块重量3-6倍的Buffer B2，然后将离心管置于50 °C水浴锅中，水浴5-10 min溶胶。
   4.3对于小于500 bp的扩增片段，加入1/3Buffer B2体积的异丙醇。
   4.4将溶胶液转移至吸附柱中，在8,000 × g条件下离心30 s。
   4.5弃去收集管中的液体，将吸附柱重新装回收集管中，向吸附柱中加入500 μl Wash Solution，在9,000 × g条件下离心30 s。重复两次。
   4.6弃去收集管中的液体，将吸附柱重新装回收集管中，在9,000 × g条件下离心1 min。
   4.7丢弃收集管，将吸附柱装在干净的1.5 ml的离心管中，在吸附膜中央加入20 μl Elution Buffer，室温条件下静置1分钟，然后在9,000 × g条件下离心1 min。
   4.8丢弃吸附柱，将离心管中回收到的DNA溶液送至华大基因科技有限公司进行测序，并将测序结果上传至Genbank。
   
5. 序列比对
   以宿主昆虫孔弄蝶为例，将测序获得的Wolbachia菌wsp基因、MLST序列与MLST数据库及NCBI数据库的同源序列进行比对并构建系统发育树，得到分型结果。
   
   
   图1. 孔弄蝶属（加粗字体）与其他昆虫物种Wolbachia菌wsp基因和MLST基因序列共同构建的ML系统发育树。孔弄蝶属感染的Wolbachia菌分布在超组A和超组B
   
   
6. 注意事项
   由于Wolbachia菌在昆虫宿主体内存在双重感染或多重感染的现象，会产生基因重组的可能，因此单独采用wsp的基因进行菌株分型，可能产生错误。因此，对Wolbachia菌的分型采用扩增5个基因 (gatB、hcpA、ftsZ、coxA、fbpA)的多基因座分型的办法。
   

致谢

致感谢上海市自然科学基金面上项目（20ZR1440800）和上海市人才发展资金资助 （2019112）的支持。实验方案摘自发表的文章 Jiang et al. (2018).

竞争性利益声明

作者声明没有利益冲突

参考文献

1. Baldo, L., Dunning, H. J. C., Jolley, K. A., Bordenstein, S. R., Biber, S. A., Choudhury, R. R., Hayashi, C., Maiden, M. C., Tettelin, H. and Werren, J. H. (2006). Multilocus sequence typing system for the endosymbiont Wolbachia pipientis. Appl Environ Microb 72(11): 7098-7110.
2. Gerth, M., Geibler, A. and Bleidorn, C. (2011). Wolbachia infections in bees (Anthophila) and possible implications for DNA barcoding. Sys Biodivers 9(4): 319-327.
3. Gray, M. W., Gertraud, B. and Lang, B. F. (1999). Mitochondrial evolution. Science 283(5407): 1476-1481.
4. Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A. and Werren, J. H. (2008). How many species are infected with Wolbachia? A statistical analysis of current data. FEMS Microbiol Lett 281(2): 215-220.
5. Jackel, R., Mora, D. and Dobler, S. (2013). Evidence for selective sweeps by Wolbachia infections: phylogeny of Altica leaf beetles and their reproductive parasites. Mol Ecol 22: 4241-4255.
6. Jiang, W. B., Zhu, J. Q., Wu, Y. J., Li, L. Z., Li, Y. Y., Ge, C., Wang, Y., Endersby, N. M., Hoffmann, A. A. and Yu, W. D. (2018). Influence of Wolbachia infection on mitochondrial DNA variation in the genus Polytremis (Lepidoptera: Hesperiidae). Mol Phylogenet Evol 129(12): 158-170.
7. Riegler, M. and O'Neill, S. L. (2006). The genus Wolbachia. Prokayotes 5: 547-561.
8. Whitworth, T. L., Dawson, R. D., Magalon, H. and Baudry, E. (2007). DNA barcoding cannot reliably identify species of the blowfly genus Protocalliphora (Diptera: Calliphoridae). Proc R Soc B 74: 1731-1739.
9. Zhou, W., Rousset, F. and O'Neill, S. L. (1998). Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. Proc R Soc B 265(1395): 50-515.