摘要:简化基因组测序技术是利用限制性内切酶等手段来降低基因组的复杂度,通过对特定的酶切片段进行高通量测序从而实现全基因组范围遗传分型的技术。其中,2b-RAD (type IIB restriction endonucleases site–associated DNA) 是唯一可实现等长标签测序分型的RAD类技术。该技术具有能够对所有酶切片段分型,可通过选择性碱基调节标签密度,建库流程简便快速,可处理高度降解或者痕量样品等优势。本方案介绍了一种串联2b-RAD标签测序技术,其兼容多种测序平台、具有灵活的标签组合方式,可实现高效全基因组遗传变异和表观遗传变异同步分析,在大规模遗传变异筛查、群体遗传进化分析以及分子育种等研究领域具有广泛的应用前景。串联2b-RAD实验方案主要包括如下步骤:1.采用IIB型限制内切酶将基因组DNA进行酶切,获得长度为30-35 bp的等长片段;2.将酶切产物与设计的接头进行连接反应;3.将得到的连接产物进行扩增并纯化;4.混合串联标签文库通过酶切连接反应,使独立的标签文库的粘性末端互补依次连接形成串联文库;5.将串联后的标签文库再次扩增,引入barcode序列完成建库。本方案还提供了串联测序文库的数据拆分方法以及基因组分型流程,以便于将获得的分型数据应用于群体遗传进化分析。
关键词: 串联等长标签, 简化基因组测序, 群体遗传分析
研究背景
简化基因组测序技术通过利用限制性内切酶对约1-10%的基因组进行测序分型,能够大幅降低基因组的复杂度,具有适用于大量样本低成本基因分型,可不依赖于参考基因组分析等优势 (Campbell et al., 2018)。近些年来,以RAD (restriction site-associated DNA sequencing) 为代表的简化基因组测序技术已成为广泛应用于动植物遗传领域基因组分型的重要手段。2b-RAD (type IIB restriction endonucleases site–associated DNA) 技术是唯一可对等长标签 (约30-35 bp) 进行测序分型的RAD类技术 (Wang et al., 2012),该技术具有可对所有酶切片段分型,可通过选择性碱基调节标签密度,建库流程简便快速,可处理高度降解或者痕量样品等优势。该技术已经被广泛应用于高精度遗传图谱绘制、重要性状遗传解析、群体遗传学分析以及全基因组选择等研究方向。Multi-isoRAD (Multi-isolength restriction site–associated DNA) 是在2b-RAD技术基础上发展起来的串联标签测序技术 (Wang et al., 2016),在一个测序片段 (read) 实现了对多达5个标签同时分析,并首次实现了全基因组SNP分型和DNA甲基化的同步联合分析。该技术解决了2b-RAD技术无法应用于双末端测序平台的局限,使得简并基因组分析成本大大降低 (单标签测序成本仅为技术改进前的十分之一)。Multi-isoRAD技术能够使研究者以较低的成本获得基因组大量的变异信息,为开展群体多样性和遗传结构分析以及群体进化和适应性机制解析提供了重要的技术手段。
材料与方法
仪器设备
实验方法
一、串联2b-RAD简化基因组文库制备
二、串联文库的测序数据分析
三、群体遗传进化分析
群体遗传分析主要使用POPGENE、PLINK1.9、Structure和Mega等软件工具包实现。
方法运用
本实验方案介绍了一种串联2b-RAD标签测序技术,该技术兼容多种测序平台、串联的标签组合可灵活设置。其中,标签类型可采用不同样品、不同内切酶以及不同应用 (SNP分型或DNA甲基化水平检测) 的组合。串联标签测序技术是一种高效、灵活的全基因组遗传变异和表观遗传变异筛查和检测的手段,在大规模遗传变异筛查、群体遗传进化分析以及分子育种等研究领域具有广泛的应用前景。
致谢
本研究受山东省泰山学者计划项目和三亚崖州湾科技城管理局项目 (SKJC-KJ-2019KY01) 资助。
参考文献
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