mRNA-Seq差异表达一般流程及高阶分析
General Pipeline and Advanced Analysis of mRNA-Seq Differential Expression   

研究背景

        利用mRNA-Seq技术测得两组或多组样本的转录组数据，并通过差异表达分析和对所发现的差异表达基因集合进行功能富集分析以推断其生物学功能，是包括动物进化研究领域在内的诸多生物学领域中被普遍应用的重要研究思路。针对此类分析流程的方法介绍目前已有很多，包括中文文章 (赵 婧和刘 南，2019)。
        然而，mRNA-Seq的实验设计往往没有被重视，与研究结果准确性息息相关的参数没有被科学严谨的选择，例如样本量和测序深度。功效分析可以帮助研究者了解既定实验在真实存在组间差异时可以统计检验出显著性差异的几率，从而有助于实验设计和对实验结果的解释。此外，实验得到的转录组数据可能由于实验前未知原因或实验中无法控制的变量出现分层的情况。这种情况更可能出现在野生动物样本的数据中，因为野外采集的样本比实验室中收集的样本更难控制各类条件。针对这种情况进行分层分析可以厘清导致分层的原因并在此基础上对数据进行分组，再基于分组后的数据进行差异表达分析。
        本文首先介绍mRNA-Seq转录组差异表达分析目前被普遍应用的一般流程，其中侧重于介绍之前中文文章 (赵 婧和刘 南，2019) 中未提及或简略提及的内容，与其互为补充。之后会针对上述两个问题介绍功效分析和分层分析的方法，以期会有助于包括动物进化领域在内的生物学研究。本文基于作者本人以第一作者于2019年发表于eLife期刊 (Xie et al., 2019)，以及第一作者兼通讯作者于2020年发表于PLoS Computational Biology期刊 (Xie et al., 2020) 的两篇开放获取 (open access) 文章中的相关内容。

仪器设备

1. Linux系统服务器 (理论上几乎当前任何配置的服务器均可以完成分析，但是读者需根据实际数据量使用相应性能的服务器；作者进行上文提到文章中的数据分析所使用的服务器配置相对比较高，即具备20个计算节点且每个节点有512GB内存和32个2.1GHz的CPU核，这样只利用部分计算资源就在很短的时间内完成了分析)。
2. 个人电脑，系统不限，用于运行R软件。此非必须，可在服务器上运行R软件。
   

软件版本信息及下载地址

        此处所列软件及其版本为下文实验步骤中及本文所基于的两篇文章中所使用的。其它相关软件及其下载地址见实验步骤中所涉及处。建议读者在实际研究工作中使用所有软件的最新版本。

1. FastQC (0.11.4, "https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/").
2. Trimmomatic (Bolger et al., 2014) (0.35, "http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic").
3. HISAT2 (Kim et al., 2019) (2.0.4, "http://daehwankimlab.github.io/hisat2/").
4. SAMtools (Li and Durbin, 2009) (1.3.1, "http://www.htslib.org/").
5. HTSeq (Anders et al., 2015) (0.6.1p1, "https://htseq.readthedocs.io/en/master/").
6. R (3.3.1, "https://www.r-project.org/").
7. DESeq2 (Love et al., 2014) (1.14.1, "https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html").
8. GOseq (Young et al., 2010) (1.38.0, "https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html").
9. RnaSeqSampleSize (Zhao et al., 2018) (1.6.0, "https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/RnaSeqSampleSize.html").

实验步骤

一、本文相关数据获取

1. 测序数据
           本文所基于的原始测序数据 (FASTQ格式)可从European Nucleotide Archive (ENA) 数据库 ("https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home") 下载 (PRJEB28348)。对数据的详细描述见本文所基于的两篇文章 (Xie et al., 2019 and 2020)。
   注1：已发表文章中的测序数据大多会被上传至上述的ENA数据库，或NCBI的Sequence Read Archive (SRA) 数据库 ("https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra")。
   注2：研究者通常得到的Illumina测序原始数据为FASTQ格式，但是有时也会得到BCL格式的文件。这时需要利用工具bcl2fastq ("https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software.html") 将其转为FASTQ格式以进行后续分析。
   
2. 基因组序列和基因注释数据
   本文所基于的小鼠基因组序列和基因注释数据可从Ensembl (Version 86)下载 ("http://ftp.ensembl.org/pub/release-86/fasta/mus_musculus/dna/Mus_musculus.GRCm38.dna.primary_assembly.fa.gz"和"http://ftp.ensembl.org/pub/release-86/gtf/mus_musculus/Mus_musculus.GRCm38.86.gtf.gz")。建议读者在实际研究工作中使用最新版本数据。对于小鼠数据，目前最新版的基因组为GRCm39/mm39。
   
   

二、mRNA-Seq转录组差异表达分析目前被普遍应用的一般流程

1. 测序数据质量评估
           通常利用FastQC工具对测序数据进行质量评估。Linux命令见图1。
   
   
   图1. FastQC命令
   
           结果文件中包含一系列质量评估项目，其中比较重要的包括测序数据的基本信息(Basic Statistics)、直观了解整体测得碱基质量(Per Base Sequence Quality)和"Adapter Content" (是否包含adapter)，详细说明见"https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Help/3%20Analysis%20Modules/"。
   
2. 原始测序数据预处理
   

           原始测序数据中可能存在低质量序列，以及一些read含有adapter，需要进行预处理以便后续分析。推荐使用Trimmomatic工具，与其它类似工具相比，其除了具有运行速度快的优点，对于双端 (paired-end) 测序的数据可以利用被称为"palindrome"的方法更加有效地处理只包含部分adapter序列的read。Linux命令见图2。
   
   
   图2. Trimmomatic命令
   
   注：对原始测序数据预处理后可再次利用FastQC检查数据质量。

3. 将测序得到的read比对到参考基因组上
           目前mRNA-Seq转录组差异表达分析通常会将经过预处理的read比对 (mapping) 到参考基因组上，并以此为基础进行后续分析。对于没有合适参考基因组，以及不通过序列比对进行差异表达分析这两种情况，均有相应的分析方法，但不在本文讨论范围之内。目前比较流行的两个工具为HISAT2和STAR (Dobin et al., 2013) ("https://github.com/alexdobin/STAR")，各具优点。本文以HISAT2为例，而上文提到的中文方法介绍 (赵 婧和刘 南，2019) 中则以STAR为例。
           首先利用hisat2-build建立参考基因组序列索引。HISAT2的一个优势是可以利用已知基因注释信息或SNP注释信息等提高序列比对能力。此例子中利用了小鼠已有基因注释信息。随后利用hisat2进行序列比对。比较重要的参数包括"--rna-strandness" (测序建库是否为stranded，以及相应方法) 和"--dta" (输出结果便于StringTie进行转录本组装)。Linux命令见图3。
   
   
   图3. HISAT2命令
   
   注1：在本例子中，由于 (1) 测序数据来源于实验小鼠系C57BL/6N，其基因组与小鼠参考基因组极为接近；(2) 小鼠基因组已有基因注释已经相对完备；以及 (3) 此分析想要得到的重点结果为已有功能注释的基因的差异表达情况，因此没有再利用测序数据组装新的转录本。如需组装新的转录本，可利用StringTie (Pertea et al.,
   2015) ("https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/") 等工具。
   注2：如上所述，由于此例子中测序数据来源于实验小鼠系C57BL/6N，其基因组与小鼠参考基因组极为接近，因此几乎使用了HISAT2所有默认参数值。但是对于样本进化距离与参考基因组相差较远的情况，或者有其他特殊分析需要时，读者需根据具体情况相应调整参数。针对样本进化距离与参考基因组相差较远的这一情况，推荐尝试修改"Scoring options"中各参数。
   注3：对于mRNA-Seq数据，在read比对后，可以利用RSeQC (Wang et al., 2012) 等工具进行mRNA-Seq特异的数据质量评估。
   
   
4. 统计比对到各基因的read/fragment数目
           在进行差异表达分析前，需要在每个样本中统计比对到各个基因 (或其它基因组区域) 的read数目。如果是双端测序，则需要统计read pair，即fragment的数目。本文中使用的工具为HTSeq中的htseq-count，但更推荐读者使用featureCounts (Liao et al., 2014) ("http://subread.sourceforge.net/")。这两个工具与其它类似工具的统计结果并没有非常大的差异，但是featureCounts运行速度更快且可选参数更多。运行htseq-count的Linux命令见图4。
   
   
   图4. HTSeq命令
   
   
5. 差异表达分析
           此步骤是mRNA-Seq转录组差异表达分析流程的核心。目前被普遍认可的分析方法是利用每个样本的"raw read/fragment gene counts"作为输入数据，利用其服从负二项分布为核心思想进行统计检验。读者如感兴趣可以通过阅读早期mRNA-Seq分析相关的一系列经典文章 (Marioni et al., 2008; Love et al., 2014; Anders and Huber, 2010; Robinson et al., 2010) 深入了解。
     目前比较流行的软件包包括DESeq2、edgeR (Robinson et al., 2010) ("https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html")、limma (Law et al., 2014) ("https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html") 等，其中前两者是利用负二项分布思想。正常情况下，对于同一组数据这些不同的方法应该得到类似的差异表达基因集合，如文章 (Xie et al., 2020) 中图3A所示。本文以DESeq2为例介绍分析方法。下面的例子为文章 (Xie et al., 2020) 中基因A930004D18Rik敲除小鼠系，胚胎期雌性敲除组 (12个胚胎) 和野生组 (14个胚胎) 的mRNA-Seq数据。R代码见图5。
   
   
   图5. DESeq2差异表达分析代码
   
   
6. 功能富集分析
           在差异表达分析后，依据所选择的显著性水平标准 (通常为Adjusted P-Value ≤ 0.05)，得到一个差异表达基因集合。为了理解这一基因集合的生物学功能意义，需要针对其进行功能富集分析。
           在差异表达分析过程中，不同基因由于各种原因 (详见功效分析) 被检验为统计显著的功效是不同的。例如对于两个其它情况相同的基因，有更多read/fragment 数目的基因更倾向于被检验为差异表达基因。因此，在功能富集分析环节需要针对这种基因间功效偏差进行校正，以避免导致得到的富集的功能条目 (Gene Ontology term或pathway) 仅仅是因为其中包含更多有高read/fragment数目的基因，进而错误地推断了生物学功能意义。基于基因集合的功能富集分析工具有很多，然而绝大多数没有考虑到mRNA-Seq中存在的功效偏差的问题，而GOseq软件包则解决了这一问题。上文例子 (图5) 的Gene Ontology (GO) 富集分析方法见下 (图6)。GOseq软件包除了可以进行GO富集分析，还可以利用如KEGG pathway等其它功能注释数据进行分析。
   
   
   图6. GOseq代码
   
   

三、功效分析

        功效分析可以帮助研究者了解既定实验在真实存在组间差异时可以统计检验出显著性差异的几率，从而有助于实验设计和对实验结果的解释。针对传统生物学实验的功效分析已被研究者普遍重视，尤其是样本量对功效的影响往往是研究者设计实验时所考虑的重点问题之一。然而，对于如mRNA-Seq等高通量实验，研究者往往只设置样本量为3-5，满足允许进行统计检验的最低标准。原因之一是高通量实验价格昂贵；而以Illumina方法为代表的测序价格逐年下降，使得这一障碍变得越来越容易跨越。即使研究者受研究经费的限制无法通过提高样本量等方式达到理想的功效，进行功效分析也可以帮助正确地理解研究结果。下面从理论分析和实际数据分析两方面介绍功效分析；前者有助于在实验前设计实验；后者对于预实验的分析有助于设计最终实验，而对最终实验的分析有助于理解实验结果。

1. 理论分析
           对于以上文中利用DESeq2为代表的基于read/fragment数目服从负二项分布思想的mRNA-Seq差异表达分析，我们可以利用RNASeqSampleSize进行功效分析。对于一个既定的基因，在一个既定的实验中其被检验为差异表达的功效与如下几个因素相关：(1) 各样本，尤其是组间样本，测序深度的均一性 (由于通常情况下各样本测序深度大致相当，我们在分析中通常将其设为w = 1)；(2) 显著性水平 (在此例子中我们设置Adjusted P-Value为0.05，总计15,000个基因被表达而被统计检验，因此Bonferroni校正后的显著性水平alpha = 3.3 × 10^-6，这里进行Bonferroni校正的原因是对单一基因的理论分析FDR校正方法不适用，实际mRNA-Seq差异表达分析中往往由于Bonferroni校正过于严格而使用FDR方法)；(3) 样本量 (n)；(4) 组间倍数改变 (fold change，rho)；(5) 样本间read/fragment数目的平均值 (lambda0)；(6) dispersion (负二项分布的参数，对于由生物学差异或技术差异导致的样本间方差在考虑到read/fragment数目的影响的标准化数值，phi0)。下面的R代码 (图7) 给出了一个计算功效的具体例子，对大量参数组合的系统分析结果可见文章 (Xie et al., 2020) 中图2A和补充表S4。研究者可以通过提高样本量和测序深度 (read/fragment数目的平均值)，以及控制生物学差异和技术差异，从而达到目标功效。读者在理论分析时可根据研究需求尝试参数选择，其中基因read/fragment数目的平均值，可以由先验的基因表达水平 (如FPKM) 和基因长度，以及平均样本read/fragment总数反推；dispersion最好依据目标样本的预实验结果确定 (见下面实际数据分析中描述)，或者利用其它类似样本的mRNA-Seq数据的估计值，7种不同样本的小鼠mRNA-Seq数据的dispersion估计值见文章 (Xie et al., 2020) 中图3C和补充表S7。
   
   
   图7. RNASeqSampleSize代码
   
   
2. 实际数据分析
           由于不同实验产生的样本基因表达谱和样本间表达差异不同，因此最好的策略是先用低样本量和低测序深度进行预实验。对预实验结果的分析可以得到各个基因的组间倍数改变 (fold change)、平均read/fragment数目和dispersion等参数，再利用这些参数进行功效分析以确定最终实验的样本量和测序深度。上述图5中的例子中，DESeq2默认的输出结果中并不含有dispersion值，需用"dispersions"函数获取 (图8)。
   
   
   图8. DESeq2获取dispersion值代码
   
           对于最终mRNA-Seq实验进行功效分析，有助于理解实验结果，即最终实验的样本量和测序深度是否有足够的功效以找到大部分真实差异表达的基因，以及是否有足够的功效以找到主要的富集的功能条目 (Gene Ontology term或pathway)。例如文章 (Xie et al., 2020) 中通过二次取样分析 (subsampling analysis) 发现，对于基因A930004D18Rik敲除小鼠系，胚胎期雌性敲除组 (12个胚胎) 和野生组 (14个胚胎) 的mRNA-Seq数据，测序深度为平均6千万个read (3千万个fragment) 足以找到大部分真实差异表达的基因 (文章 (Xie et al., 2020) 图2C)；但样本量为10不足以找到大部分真实差异表达的基因 (文章 (Xie et al., 2020) 图2B)。
   
   

四、分层分析
        由于实验前未知原因或实验中无法控制的变量，可能会导致得到的转录组数据出现分层的情况，比如下例中转录组样本位于动情周期的不同阶段。针对这类情况进行合适的数据分析，如主成分分析、聚类分析和标志基因分析，可以厘清导致分层的原因。在此基础上可以先将所有样本进行分组，并在各组中分别进行差异表达分析。本文使用文章 (Xie et al., 2019) 中基因Gm13030/Shj敲除小鼠系，成年雌性敲除组 (12只小鼠) 和野生组 (12只小鼠) 输卵管的mRNA-Seq数据为例说明分层分析。在最初的差异表达分析中，没有发现任何统计显著的基因。其中一个可能的原因是成年雌性小鼠在动情周期不同阶段具有不同的表达谱和不同的基因差异表达现象。因此，在差异表达分析前首先需要厘清动情周期各阶段。我们通过主成分分析 (本例中区分来自主成分1) 和层次聚类分析将所有样本分为三组；并通过对标志基因 (marker gene)，即孕激素受体和雌激素受体 (Pgr、Esr1和Gper1)的表达水平分析，确证了这三组对应于动情周期的三个不同阶段。主成分分析、层次聚类分析和标志基因分析方法见下面R代码 (图9)，结果见文章 (Xie et al., 2019) 中图4。对这三个阶段的样本分别进行差异表达分析，发现在其中的一个阶段有21个统计显著的差异表达基因，但在另两个阶段没有任何差异表达基因。


图9. 主成分分析、聚类分析和标志基因分析代码

注：差异表达分析基于原始read/fragment数目，并在统计检验模型中统一处理各类因素；但主成分和聚类分析基于标准化及"log2 scale"转化后的read/fragment数目以消除样本间差异以及减小不同基因长度和表达水平间差异。

小结与建议

        本文介绍了mRNA-Seq转录组差异表达分析目前被普遍应用的一般流程，以及介绍了功效分析和分层分析的方法。建议读者在mRNA-Seq转录组实验设计阶段进行初步功效分析。如果可能的话，在最终实验前安排低样本量和低测序深度的预实验，以进行功效分析找到最终实验的最佳方案；同时也初步分析是否存在样本分层现象。在得到最终实验数据后，优先分析样本是否存在分层现象，如果存在分层则要在区分各层后分别进行差异表达分析；此外，对最终实验的功效分析有助于对结果的理解。希望本文会有助于包括动物进化领域在内的生物学研究。

竞争性利益声明

作者声明不存在竞争性利益。

伦理学声明

本文无需伦理学声明。

致谢

感谢中国科学院动物研究所朱朝东教授邀请撰文。感谢本文所基于的两篇文章的其他作者的支持，尤其是Max Planck Institute for Evolutionary Biology的Diethard Tautz教授的支持。

参考文献

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