蝴蝶ATAC-seq文库构建
Construction of ATAC-seq Library for Butterfly   

研究背景

真核细胞通过将基因组DNA与组蛋白折叠形成核小体，核小体再进一步进行不同层次的折叠组装成染色质，这些精密的组装信息在基因转录调控中起决定性作用。染色质区域的开放性是特异性反式作用因子和顺式调控元件相互作用的前提，基因表达的异常或染色质调控因子的改变都将对细胞的命运产生深远的影响 (Schwartzentruber et al., 2012; Tsompana and Buck, 2014)。美国William J. Greenleaf开发的ATAC-seq技术 (Buenrostro et al., 2015) 是鉴定转录调控序列有效方法。该技术所需的生物样本量小 (只需大约50,000个细胞)、建库流程简单 (约4 h)、重复性高、灵敏度高、并能一次性获得全基因组开放染色质的信息等优点，因此，该技术在昆虫研究中的应用也越来越广泛；例如，帝王蝶大脑调节昼夜转录节律的基因调控模式 (Lugena et al., 2019)、鹿眼蛱蝶翅膀变态发育过程中染色质动态变化 (van der Burg et al., 2019)、蚊子的染色质结构和功能 (Lezcano et al., 2020)、果蝇神经元活性调控基因的鉴定 (Chen et al., 2016) 等。
本研究参考William J. Greenleaf等 (Buenrostro et al., 2013; Buenrostro et al., 2015; Lewis and Reed, 2019) 的方法对非模式动物蝴蝶幼虫进行了ATAC-seq文库的构建。

材料与试剂

1. 移液吸头
2. 离心管
3. 一次性培养皿
4. Corning cell strainer 40 µm Nylon (BD, catalog number: 352340)
5. 无水乙醇 (Merck, catalog number: 459844-2.5 L)
6. TE buffer (pH 8.0) (Solarbio, catalog number: T1120)
7. Nuclease-Free water (NEB, catalog number: B1500S)
8. DEPC H₂O (Invitrogen, catalog number: AM9915G)
9. 1×Phosphate-buffered saline (PBS) (pH 7.2) (Cell Signaling, catalog number: 9872L)
10. 0.25% Trypsin-EDTA (Gibco, catalog number: 25200056)
11. Calf serum (ExCell, catalog number: NCD100)
12. TruePrep™ DNA Library Prep Kit V2 for Illumina (Vazyme, catalog number: TD501-01/502-01/503-01)
13. MinElute PCR purification kit (Qiagen, catalog number: 28004)
14. Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter, catalog number: A63881)
15. Qubit dsDNA HS Assay kit (Invitrogen, catalog number: Q32851)
16. Agilent High Sensitivity DNA kit (Agilent, catalog number: 5067-4626)
17. Lysis缓冲液 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 (Merck, catalog number: T2694), 10 mM NaCl (Diamond, catalog number: A100241-0500), 0.2% IGEPAL CA-630 (Merck, catalog number: I8896))
    

仪器设备

1. 解剖刀
2. 解剖剪
3. 镊子
4. 血球计数板
5. DynaMagTM-2磁力架 (Invitrogen, catalog number: 12321D)
6. 恒温水浴摇床 (GFL 1092, Germany)
7. 冷冻离心机 (Eppendorf, catalog number: 5810 R)
8. 体视显微镜 (Nikon, catalog number: SMZ745)
9. ProFlex PCR System (Thermofisher, catalog number: 4484075)
10. Qubit^TM 4 荧光计 (Invitrogen, catalog number: Q33238)
11. Agilent 2100 Bioanalyzer System (Agilent, catalog number: G2939BA)
    

实验步骤

1. 获取细胞核
   1)

   以蝴蝶样品为例，取适龄幼虫一只，剔除肠道内的内容物，用解剖剪剪成1 mm²的小块；然后，用1×PBS缓冲液洗涤三次 (洗去组织表面的杂质)，加入0.25% Trypsin-EDTA (没过组织) 置于37 °C恒温水浴摇床中消化1 h；消化后的组织使用40 µm Nylon过滤收集滤液，并加入一滴Calf serum抑制Trypsin的作用；收集的消化液4 °C 300× g离心5-10 min，弃上清，获得的细胞颗粒使用1×PBS缓冲液洗涤两次，并离心收集干净的细胞颗粒；使用1×PBS缓冲液悬浮细胞，计数 25,000-75,000个细胞进行接下来的实验 (使用太少或太多的细胞会导致消化过度或消化不足，从而降低文库的质量)。
   2)

   将步骤1)中的细胞悬液4 °C 500× g离心5-10 min (视沉淀情况而定) 收集细胞颗粒，弃去上清。
   3)

   用预冷的1×PBS缓冲液洗涤细胞颗粒，4 °C 500× g离心5-10 min收集细胞颗粒，弃去上清。
   4)

   加入50 µl预冷的Lysis缓冲液 (使细胞在去离子洗涤剂中裂解)，用移液器轻轻地吹打细胞，重悬细胞。
   5)

   冰上静置10 min，4 °C 500× g离心5-10 min收集细胞颗粒，弃去上清，立刻进行转座反应。
2. 转座反应
   使用TruePrep™ DNA Library Prep Kit V2 for Illumina试剂盒配置转座反应混合液 (如下表)，使用转座反应混合液重新悬浮细胞颗粒，37 °C水浴30 min，进行转座反应。
   
   
3. 纯化转座产物
   使用Qiagen MinElute PCR purification kit对步骤2中的转座产物进行纯化。
   1)

   25 µl转座产物转移到1.5 ml Nuclease-Free离心管中。
   2)

   加入125 µl PB Buffer，混匀。
   3)

   把混合的样品加入柱子中，室温13,000 rpm离心60 s，弃去废液，柱子放回离心管中。
   4)

   加入PE Buffer，室温13,000 rpm离心60 s，弃去废液，柱子放回离心管中。
   5)

   室温13,000 rpm离心60 s，把柱子放入新的1.5 ml Nuclease-Free离心管中，晾干2 min。
   6)

   加入20 µl Nuclease-Free water，室温13,000 rpm离心60 s，收集纯化产物。
   7)

   使用Qubit dsDNA HS Assay kit对纯化产物进行浓度检测，此纯化产物可于-20 °C保存待用。
4. PCR扩增
   PCR扩增纯化后的转座产物，在PCR离心管中混合扩增体系。
   1)

   配制PCR反应液：
   
   
   2)

   PCR扩增程序：
   
   注：为了减少GC和PCR反应中片段长度偏好性，合适的PCR反应的循环数需要通过qPCR来确定，在饱和之前停止扩增反应。
   
5. PCR产物纯化
   PCR产物使用预先在室温平衡30 min的Agencourt AMPure XP Beads进行纯化。
   1)

   吸取15 µl AMPure XP Beads至PCR产物中，混匀，室温孵育5 min。
   2)

   置于磁力架上静置5 min，转移上清液至新的离心管中，弃去磁珠。
   3)

   吸取3.75 µl AMPure XP Beads至步骤2) 的上清液中，混匀，室温孵育5 min。
   4)

   置于磁力架上静置5 min，澄清后弃去上清液。
   5)

   加入新鲜配制的75%乙醇，静置30 s澄清后，弃去上清液。
   6)

   重复步骤5) 一次。
   7)

   加入20 µl TE buffer，混匀，室温孵育5 min。
   8)

   置于磁力架上静置5 min，收集上清液，即为ATAC-seq文库，可于-20 °C保待用。
6. ATAC-seq文库质控
   1)

   使用Qubit dsDNA HS Assay kit对文库的浓度进行初步定量。
   2)

   使用Agilent High Sensitivity DNA kit检测文库DNA片段的完整性及插入片段的大小。
   3)

   qPCR法对文库的有效浓度进行精确定量。
7. ATAC-seq文库测序
   所获得的ATAC-seq文库使用Illumina HiseqXten (PE150) 平台进行上机测序，测序深度根据项目的设计进行确定。我们在蝴蝶的研究中一般每个样品获取10-12 Gb的数据量。
   

致谢

感谢国家自然科学基金委员会创新研究群体 (31621062)、国家自然科学基金委员会面上项目 (32070482)、中国科学院西部之光项目 (A类) 对中国科学院昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验室的支持。

参考文献

1. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y. and Greenleaf, W. J. (2013). Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat methods 10 (12): 1213-1218.
2. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y. and Greenleaf, W. J. (2015). ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol 109: 21-29.
3. Chen, X., Rahman, R., Guo, F. and Rosbash, M. (2016). Genome-wide identification of neuronal activity-regulated genes in Drosophila. Elife 5: e19942.
4. Lewis, J. J. and Reed, R. D. (2019). Genome-wide regulatory adaptation shapes population-level genomic landscapes in Heliconius. Mol Biol Evol 36: 159-173.
5. Lezcano, O. M., Sanchez-Polo, M., Ruiz, J. L. and Gomez-Diaz, E. (2020). Chromatin structure and function in Mosquitoes. Front Genet 11: 602949.
6. Lugena, A. B., Zhang, Y., Menet, J. S. and Merlin, C. (2019). Genome-wide discovery of the daily transcriptome, DNA regulatory elements and transcription factor occupancy in the monarch butterfly brain. PLoS Genet 15 (7): e1008265.
7. Schwartzentruber, J., Korshunov, A., Liu, X. Y., Jones, D. T., Pfaff, E., Jacob, K., Sturm, D., et al. (2012). Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature 482 (7384): 226-231.
8. Tsompana, M. and Buck, M. J. (2014). Chromatin accessibility: a window into the genome. Epigenetics Chromatin 7(1): 33.
9. van der Burg, K. R. L., Lewis, J. J., Martin, A., Nijhout, H. F., Danko, C. G. and Reed, R. D. (2019). Contrasting roles of transcription factors spineless and EcR in the highly dynamic chromatin landscape of butterfly wing metamorphosis. Cell Rep 27: 1027-1038.