鸟类血孢子虫的系统分类鉴定和感染强度的定量检测
Molecular Identification and Quantitation of Avian Haemosporidian Parasites   

研究背景

鸟类血孢子虫 (avian haemosporidians) 是人疟原虫的近缘物种且为从共同祖先较早分化出的一支 (Galen et al., 2018)，数十年来一直是研究疾病传播机制和种间协同演化的模式类群 (Rivero and Gandon, 2018)。鸟类血孢子虫主要包括疟原虫属 (Plasmodium)、血液变形虫属 (Haemoproteus) 和住白细胞原虫属 (Leucocytozoon) 等，由蚊、蠓和蚋等双翅目 (Diptera) 吸血昆虫传播 (Valkiūnas, 2005)，是鸟类中最常见的血液寄生虫 ( Rivero and Gandon, 2018; Dunn and Outlaw, 2019)，当前基于线粒体细胞色素b基因 (cyt b) 条形码序列定义的谱系支 (lineage) 已超过4,000个，在全球除南极洲以外的所有地区感染了约2,000种鸟类宿主 (Bensch et al., 2009)，并对被感染鸟类的健康乃至生存造成严重威胁。这些血孢子虫谱系支所感染的宿主种类与地理分布范围不尽相同，其中大部分感染病例 (infection cases) 为能感染多种鸟类宿主的泛性寄生虫 (或称为广宿主寄生虫，generalist parasite) 所引发。对泛性寄生虫如何适应不同的宿主这一问题的解答，是揭示宿主和寄生虫协同演化关系的关键。
    由于鸟类宿主行为和免疫功能的差异，泛性血孢子虫对不同鸟类宿主的适应能力并不相同 (Fenton et al., 2015)，通常表现在感染率 (prevalence) 和感染强度 (infection intensity) 两方面。感染率即鸟类种群中被感染个体的比例，反映了寄生虫感染宿主的能力；感染强度即血孢子虫在鸟类宿主体内的种群数量，以被感染红细胞的比例衡量(Pigeault et al., 2015)，反映了寄生虫在宿主体内繁殖的能力。
    传统的血孢子虫检测方法是在显微镜下观察鸟类血涂片，根据血细胞中寄生虫配子母细胞或裂殖体 (仅疟原虫) 的大小、形状、位置、色素排列等一系列形态特征对其进行分类鉴定；并通过对数百个视野中被感染细胞的直接计数获得血孢子虫的感染强度 (Valkiūnas, 2005)。血涂片镜检法对检测者经验和血涂片质量的要求较高，且灵敏度有限，而野生鸟类的感染强度通常较低，因此常出现假阴性结果。此外，镜检法很难区分形态特征极为相似的隐存种，尤其对隐存种众多的疟原虫属，镜检法往往低估了血孢子虫的多样性。
    随着科学技术的发展，基于PCR (Polymerase Chain Reaction) 技术的分子方法逐渐普及，大大提升了检测效率、灵敏度和精确性。本文将分为三个章节，依次介绍基于巢式PCR (nested PCR) 的鸟类血孢子虫系统分类鉴定、基于实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, qPCR) 的相对定量检测，以及基于数字式微滴PCR (digital droplet PCR, ddPCR) 的绝对定量检测方法的实验流程和数据分析方法。

一、基于巢式PCR对鸟类血孢子虫进行系统分类鉴定

研究背景

鸟类血孢子虫物种多样，能感染的宿主种类和数量也各不相同。因此，对血孢子虫进行准确的系统分类鉴定是研究其与宿主相互关系的基础。随着分子生物学的发展以及技术的不断完善，2000年，基于聚合酶链式反应 (PCR) 技术的分子鉴定方法首次被用于鸟类血孢子虫的研究 (Bensch et al., 2000)，该方法对血孢子虫线粒体基因组细胞色素b基因 (cyt b) 的479 bp的片段 (条形码片段) 进行扩增和测序分析，在该片段出现一个碱基的差异便会被认定为不同谱系支 (lineages)。在此基础上改良的巢式PCR则进一步提高了扩增的可靠性和灵敏度 (Hellgren et al., 2004)。巢式PCR使用两对引物依次进行PCR扩增 (图1)。第一轮扩增的靶序列略长于条形码片段，第二轮则以第一轮扩增的产物为模板，用两对引物分别对目标片段进行再次扩增。其中一对引物 (HaemF-HaemR2) 适用于疟原虫属和血液变形虫属寄生虫的扩增和物种鉴定，另一对 (HaemFL-HaemR2L) 则适用于住白细胞原虫属。如果第一轮扩增产生了错配，第二轮扩增中错误片段与引物结合的概率极低。因此，相比单一PCR，巢式PCR大大提高了扩增的特异性。同时由于两次富集使目标片段大量扩增，巢式PCR的灵敏度也高于单一PCR。研究表明，即使将野外采集的鸟类血液样品稀释一百多倍，巢式PCR仍然能够准确鉴定出阳性个体 (Waldenström et al., 2004)。


图1. 巢式PCR引物及其目标序列（引自 Hellgren et al. (2004)，已授权）

    本方法一经面世便得到广泛应用，目前已发表的基于此方法鉴定的鸟类血孢子虫谱系支的条形码序列、感染的鸟类物种、地理分布等信息均收录于MalAvi数据库中 (Bensch et al., 2009)。将血孢子虫条形码序列与数据库进行比对便可对其进行系统分类学鉴定。
    本文介绍了利用巢式PCR鉴定鸟类血孢子虫和通过序列比对进行系统分类鉴定的详细流程。

材料与试剂

1. 移液器吸头 (AxyGen，加利福利亚，美国，0.1-2.5 μl, 1-10 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl)
2. 1.5 ml离心管 (Eppendorf，德国)
3. PCR管或96孔板 (Eppendorf)
4. 96孔板封膜或硅胶盖 (Eppendorf)
5. 50 ml试剂槽 (BBI，catalog number: F619711)
6. Premix TaqTM酶 (Takara，日本， catalog number: RR330A)
7. DNA分子量标准Marker (生工，上海，DL2000，catalog number: B500350)
8. 50× TAE 缓冲液 (生工，catalog number: B548101)
9. 琼脂糖 (生工，catalog number: A620014)
10. 引物3对 (由测序公司合成，见表1)
    
    表1. 巢式PCR引物信息

    	引物名称	引物序列 (5'-3')
    第一轮	HaemNFI	CATATATTAAGAGAATTATGGAG
    	HaemNR3	ATAGAAAGATAAGAAATACCATTC
    第二轮 (住白细胞原虫)	HaemFL	ATGGTGTTTTAGATACTTACATT
    	HaemR2L	CATTATCTGGATGAGATAATGGHGC
    第二轮 (疟原虫/血液变形虫)	HaemF	ATGGTGCTTTCGATATATGCATG
    	HaemR2	GCATTATCTGGATGTGATAATGGT

仪器设备

1. 移液器 (Eppendorf，德国，量程 0.1-2.5 μl, 1-10 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl)
2. 离心机 (Eppendorf Centrifuge 5810R)
3. PCR仪 (Applied Biosystems，加利福利亚，美国，catalog number: 435786)
4. 微波炉
5. 电泳仪 (Bio-Rad，加利福利亚，美国)
6. 凝胶电泳成像仪 (基因有限公司，香港)
   

分析软件

1. Genious (Biomatters, Ltd. https://www.geneious.com/)
2. R (R Core Team, https://www.r-project.org/)

实验步骤

1. 样品准备
   
   1)

   在冰上融化引物和试剂。
   2)

   在冰上配制第一轮PCR反应体系预混液。计算所需的试剂体积，将缓冲液、引物和酶在1.5 ml离心管中混合，振荡混匀，短暂离心收集管壁上液滴， 完成无模板的预混液制备。使用96孔板时可以在条形试剂槽中混匀，用排枪上样。考虑到移液过程中的损失，预混液的总体积为 (单个反应体积) × (实际 反应数 + 1) 。第一轮 PCR 的产物体积仅需满足第二轮反应对模板用量的要求即可，因此通常采用较小的反应体系以减少不必要的试剂和引物消耗，通常采用20 μl反应体系，根据待检测样品的数量，建议配制方法如表2所示。
   
   表2. PCR反应体系 (20 μl) 及其各成分配比

   试剂	单个反应 (20 μl)		24个样品 (25×)	96板整版 (100×)
   ddH2O	7.2		180	720
   正向引物	0.4		10	40
   反向引物	0.4		10	40
   Taq premix (2×)	10		250	1,000
   DNA 模板	2		-	-
   总计	20		450

   
   
   3)

   在已灭菌的PCR反应管或96孔板中加入预混液。
   4)

   向有预混液的PCR管中加入 DNA 模板，每轮反应至少包含1个阴性对照和 1个阳性对照，阳性对照通常选用感染强度较高的样品；阴性对照可采用确定无感染的样品，或以ddH₂O代替DNA模板。
2. 第一轮PCR反应，引物HaemNF1-HaemNR3 (通用)
   设置反应程序。[94 °C - 5 min] + [94 °C - 30 s, 50 °C - 30 s, 72 °C - 45 s] × 20 cycles + [72 °C - 5 min]
3. 第二轮PCR反应，引物HaemF-HaemR2 (疟原虫/血液变形虫) ,HaemFL-HaemR2L (住白细胞原虫)
   
   1)

   在冰上配制第二轮PCR反应体系预混液。配制方法同第1步。第二轮PCR反应需确保有足够产物用于后续的Sanger测序，通常采用40 μl体系，因此试剂用量为表1中的2倍。
   2)

   向PCR反应管中加入预混液和DNA模板。模板为第2步获得的PCR产物。
   3)

   设置反应程序。[94 °C - 5 min] + [94 °C - 30 s, 50 °C - 30 s, 72 °C - 45 s] × 35 cycles + [72 °C - 5 min]
4. 电泳检测
   
   1)

   将TAE缓冲液稀释后与琼脂糖混合，微波加热溶解，制备1%琼脂糖凝胶。
   2)

   取3 μl第二轮反应产物与3 μl上样缓冲液混合后，加入凝胶上样孔，120 V电泳15 min，在凝胶电泳成像仪中以紫外光照射成像，根据500 bp位置 有无条带判断样品是否被血孢子虫感染 (图2)。
   
   
   图2. 第二轮PCR产物的电泳结果图。其中092、093、095为阳性样品。

数据分析

1. 测序分析
   
   1)

   将阳性样品送至测序公司进行Sanger测序。由于鸟类血孢子虫多样性极高，如果采样地点已有的相关研究较少，则检测到新谱系支的可能性很高，建议采用双向测通以确保准确性。若采样地点的血孢子虫多样性本底已较为熟悉，则疟原虫/血液变形虫仅用正向测序即可，住白细胞原虫仍建议双向测通。
   2)

   获得序列后检查测序峰图 (abi文件)， 删除首尾有重叠峰或峰图不清晰的部分，以确保结果的准确性。删去可能测到的引物序列，避免影响比对结果。可用Geneious软件的'Trim primer'功能去除序列两端的引物片段 (图3)。
   
   
   图3. 用Geneious软件 (v.20.1) 去除测得序列中引物片段的操作界面，两端红色部分为去除的引物序列。该序列为两个血孢子虫的混合序列，在75和160碱基处分别为A/T和A/G重叠峰，可根据已知信息手动拆解。
   
   
   3)

   在野生鸟类中，混合感染（即同一只个体被两种甚至更多种血孢子虫谱系支感染）的现象较为普遍 (Valkiūnas et al., 2006)。对于被不同属血孢子虫混合感染的个体，由于PCR的产物主要取决于前四次循环中引物所结合的模板序列，而混合感染中引物和血孢子虫的结合具有较大的随机性 (Ciloglu et al., 2019)，绝大多数情况下一次实验中只会扩增其中一种。对于被同属不同血孢子虫，尤其是序列较为相似的谱系支感染的个体，则可能出现同时扩增的情况。此时测序所得的峰图中会出现重叠峰，当重叠峰较少时，可以根据与数据库、同一地区以及同一批样品中的血孢子虫序列的比对结果手动拆解。以图3为例，序列中第75和第160个碱基位置存在重叠峰，则可认为该个体被两个谱系支同时感染，其序列相差两个碱基。如果同一批样品中检测到与之其他碱基均相同、该两处分别为T和A血孢子虫，则可认为该谱系支为其中之一；另一个谱系支这两处碱基则分别为A和G。当重叠峰过多，或其中没有与已知序列相似度为100%的谱系支时，无法根据已有信息拆解，则需要进行重复实验。
2. 系统分类鉴定
   
   1)

   通过与MalAvi数据库中收录的序列进行比对，确定样品中鸟类血孢子虫的系统分类地位。常用的鸟类血孢子虫序列比对方法有三种。
   

   1. 将所获序列复制粘贴至MalAvi数据库BLAST模块 (http://130.235.244.92/ Malavi/blast.html) 直接比对，比对方法与NCBI的BLAST模块相同。
   2. 用Geneious软件，将数据库中所有序列导入Geneious并设置为自定义数据库，再用blast功能进行比对，该方法可以同时比对多条序列 (图4)。
      
      
      图4. 用Geneious软件 (v.20.1) 自定义数据库对血孢子虫进行比对的操作界面
      
   
   
   3. 在R软件中用malaviR软件包 (Ellis et al., 2017) 下的blast_malavi功能进行序列比对，运行代码为：
      #安装软件包
      devtools::install_github("vincenzoaellis/malaviR", build_vignettes = TRUE)
      #载入软件包
      library(malaviR)
      #导入测得的序列
      Seq <- "GCAACTGGTGCTTCATTTGTATTTATT
      TTAACTTATTTACATATTTTAAGAGGATTAAATTATTC
      ATATTCATATTTACCTTTATCATGGATATCTGGATTAA
      TAATATTTTTAATATCTATAGTAACAGCTTTTATGGGT
      TACGTATTACCTTGGGGTCAAATGAGTTTCTGGGGTGC
      TACCGTAATAACTAATTTATTATATTTTATACCTGGAC
      TAGTTTCATGGATATGTGGTGGATATCTTGTAAGTGAC
      CCAACCTTAAAAAGATTCTTTGTACTACATTTTACATT
      TCCTTTTATAGCTTTATGTATTGTATTTATACATATAT
      TCTTTCTACATTTACAAGGTAGCACAAATCCTTTAGGG
      TATGATACAGCTTTAAAAATACCCTTCTATCCAAATCT
      TTTAAGTCTTGATATTAAAGGATTTAATAATGTATTAG
      TATTATTTTTAGCACAAAGTTTATTTGGAATACT"
      #和MalAvi数据库比对，获得相似度最高的5个lineage信息
      hits <- blast_malavi(seq)
      #检查比对结果
      hits
      
      
   2)

   如果与最相近序列相似度为100%，则可确定为相同谱系支；如果相似度低于100%（即存在一个或更多碱基差异），则定义为新谱系支，可根据相似谱系支的种属信息推断其系统发育地位。新谱系支的命名方法为鸟类宿主拉丁名的属名前三位、种名前三位加数字，如在银喉长尾山雀 (Aegithalos caudatus) 中首次发现的谱系支命名为AEGCAU01。

致谢

实验方案摘自文章A new PCR assay for simultaneous studies of Leucocytozoon, Plasmodium, and Haemoproteus from avian blood (Hellgren et al., 2004).

二、基于实时荧光定量PCR技术对鸟类血孢子虫进行相对定量检测

研究背景

寄生虫对特定宿主的感染强度，即在该宿主个体内的种群大小，反应了其在宿主体内繁殖的能力，是衡量寄生虫对宿主适应能力的重要指标 (Huang et al., 2018)。由于急性感染经常导致宿主死亡或不活跃，在野外捕获的鸟类几乎都处于感染强度较低的慢性感染期 (Mukhin et al., 2016)，因此制作的血涂片往往缺乏数量足够的、处于不同生活史阶段的血孢子虫，使其很难满足镜检的质量要求。实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR，qPCR) 技术在常规PCR的基础上加入荧光染料，染料可以与DNA双链相结合，通过对扩增过程中荧光信号的实时监测完成对模板中目标片段拷贝数的相对定量 (Kubista et al., 2006)。根据荧光信号的变化可将反应分为三个时期（图5）：基线期，体系中目标片段较少，荧光信号主要来源于模板中的DNA双链；对数增长期，目标片段大量扩增，荧光信号随之上升；平台期，体系中的dNTP等原料已消耗殆尽，酶活也降低，因此目标片段扩增效率极低，荧光信号几乎不再变化。根据基线期的荧光信号强度可设定阈值，体系中荧光信号到达阈值时所处的PCR反应循环数即为Ct值 (cycle of threshold)，模板中目标片段越多，荧光信号到达阈值的时间越早，即Ct值越低。由于理想的PCR扩增效率为100%，即每个循环结束时体系中目标基因拷贝数为上一循环结束时的2倍，通常认为Ct值增加1意味着模板中目标片段数量降低1/2。


图5. 实时荧光定量PCR反应过程中荧光信号变化

    PCR反应完成后的熔解反应则通过快速升温使体系中所有DNA双链解开，接着急剧降温再逐步升高温度，监测荧光信号的变化。由于不同长度、不同序列的DNA双链结合温度不一致，通过对熔解曲线的分析可以排除引物二聚体和非特异扩增导致的假阳性结果。qPCR方法便于操作，灵敏快捷，对模板质量要求较低，与血涂片镜检、常规PCR相比灵敏度和可重复性均较高。目前qPCR相对定量操作方法在多个实验室中被广泛使用，包括能扩增绝大多数血孢子虫的通用方法 (Friedl and Groscurth, 2012; Bell et al., 2015)和多种扩增特定血孢子虫的特异性方法 (Marzal et al., 2008; Asghar et al., 2011; Schoener et al., 2017)，为研究血孢子虫在不同宿主中适应性差异、与宿主相互关系的时空动态及其影响因素建立了基础。由于操作和分析方法均大同小异，本文仅介绍通用方法。

材料与试剂

1. 移液器吸头 (BBI，上海，0.1-2.5 μl, 1-10 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl)
2. 1.5 ml离心管 (Eppendorf)
3. 50 ml试剂槽 (BBI，catalog number: F619711)
4. 光敏96孔板 (Applied Biosystems，加利福利亚，美国，catalog number: 4306737)
5. 光敏96孔板封膜 (Applied Biosystems，catalog number: 4360954)
6. TaKaRa TB Green™ Premix Ex Taq™ (Takara, catalog number: RR820A)
7. 引物2对 (由测序公司合成，见表3)
   
   表3. 实时荧光定量PCR引物信息

   	引物名称	引物序列 (5'-3')
   血孢子虫	RNA_343F	GCTCACGCATCGCTTCT
   	RNA_496R	GACCGGTCATTTTCTTTG
   鸟类宿主	SFSR/3Fb	ACTAGCCCTTTCAGCGTCATGT
   	SFSR/3Rb	CATGCTCGGGAACCAAAGG

仪器设备

1. 移液器 (Eppendorf，德国，量程 0.1-2.5 μl, 1-10 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl)
2. 离心机 (Eppendorf)
3. 7500快速实时荧光定量PCR仪 (Applied Biosystems，加利福利亚，美国)
   

分析软件

1. 7500 Software v2.3 (Applied Biosystems)

实验步骤

1. 样品准备
   
   1)

   将模板、引物和试剂置于冰上融化，TBGreen 和ROX可以短暂存放于4 °C 冰箱。
   2)

   在冰上配制反应体系预混液。计算反应所需的试剂体积，将TBGreen、ROX、ddH₂O和引物在1.5 ml离心管中混合，振荡混匀，短暂离心收集管壁上液滴，完成无模板的预混液制备。检测整板样品时可以在条形试剂槽中混匀，用排枪上样。考虑到移液过程中的损失，预混液的总体积为 (单个反应体积) × (实际反应数 + 1)。7500仪器建议的qPCR反应体系为20 μl，根据待检测样品的数量，推荐配制方法如表4所示。
   
   表4. PCR反应体系 (20 μl) 及其各成分配比

   试剂	单个反应 (20 μl)	24个样品 (25×)	96板整版 (100×)
   ddH2O	6	150	600
   ROX	0.4	10	40
   正向引物	0.8	20	80
   反向引物	0.8	20	80
   TB Green (2×)	10	250	1,000
   DNA 模板	2	-	-
   总计	20	450

   
   
   3)

   在光敏96孔板中加入18 μl预混液。
   4)

   向有预混液的PCR管中加入 DNA 模板，每轮反应中，每个样品均重复2-3次，并至少包含2个阴性对照和2个阳性对照，阳性对照通常选用感染强度适中的样品 (Ct值约25-30)；阴性对照可采用确定未感染的样品，或以ddH₂O代替DNA模板。
   5)

   将96孔板放入离心机，配平后中速离心，确保样品管中没有气泡、管壁没有沾上液滴。
   注意：不可以在96孔板或封膜上用马克笔做任何标记！否则会影响荧光检测。
2. 血孢子虫定量检测
   
   1)

   设置反应程序。Instrument：7500 (96Wells); Type of Experiment: Quantitation – Comparative Ct; Reagent: SYBR Green; Include Melt Curve。如果实验室有已知感染强度的样品，则可将其梯度稀释后作为标准品，Type of Experiment项选择Quantitation - Standard Curve。
   2)

   在7500软件中录入每一个反应管中的目标基因和样品信息。
   3)

   设置反应条件。
   

   1. 血孢子虫定量：[95 °C - 1 min] + [95 °C - 5 s, 52 °C - 34 s, 72 °C - 30 s] × 40 cycles + [熔解曲线荧光信号采集95 °C - 15s, 60 °C - 1min, 95 °C - 15 s]
   2. 鸟类红细胞定量：[95 °C - 1 min] + [95 °C - 5 s, 57 °C - 34 s, 72 °C - 30 s] × 40 cycles + [熔解曲线荧光信号采集95 °C - 15s, 60 °C - 1 min, 95 °C - 15 s]
   4)

   将96孔板放入仪器，开始PCR反应。反应过程中可以实时监测荧光信息 (图6）。
   
   
   图6. 实时荧光定量PCR反应界面，包括反应程序、反应管中样品和目标基因、荧光信号信息

数据分析

1. 扩增曲线分析
   
   1)

   根据扩增曲线手动调整荧光强度阈值。阈值应略高于基线期的最高值以确保准确性。检查阴性对照样品，如果出现较低Ct值则表明实验过程中可能有污染，结果不可信。如果同一个样品的两个重复的Ct值相差较大，则结果不可信，需要重复实验；如果较为一致，则取其平均值以待分析。
   2)

   如果选择标准曲线反应程序，检查标准曲线和扩增效率 (图7)。理想的扩增效率应在90%-110%间。
   
   
   图7. 实时荧光定量PCR反应的标准曲线
   
   
2. 熔解曲线分析
   检查熔解曲线，根据最高峰的位置排除非特异扩增 (图8)。确保结果可信后，导出数据至Excel文件。
   
   
   图8. 实时荧光定量PCR反应的熔解曲线 右侧为阳性样品，呈现目标片段的熔解峰，左侧为阴性对照，呈现引物二聚体的熔解峰。根据熔解峰出现温度的差异可排除非特异扩增。
   
   
3. 计算血孢子虫感染强度
   如果采用标准曲线法，软件会自动计算目标DNA的量；如果采用相对定量法，则根据待检测样品 (X) 和阳性对照 (Positive control, P) 的Ct值差异，计算样品中目标DNA相对量，QX=2^CtP-CtX，若阳性对照中血孢子虫的含量 (QP) 已知，则待检测样品中血孢子虫含量的绝对值为QX × QP。结合血孢子虫和宿主的定量检测结果，感染强度为。
   

致谢

实验方案摘自文章Are chronic avian haemosporidian infections costly in wild birds? (Asghar et al., 2011)和Generalist haemosporidian parasites are better adapted to a subset of host species in a multiple host community(Huang et al.,2018).

三、基于数字式荧光PCR技术对鸟类血孢子虫进行绝对定量检测

研究背景

实时荧光定量PCR实现了对鸟类血孢子虫的相对定量，但其结果高度依赖于标准品的选择，很难做到标准化的评估，导致不同实验室、不同年度间获得的实验结果缺乏可比性 (Huang, 2021)。近年来兴起的数字式微滴PCR (ddPCR) 由于极高的灵敏度和不依赖于标准品即可定量检测的优点，已在多个领域得以应用。ddPCR系统在传统的 PCR扩增前将反应体系进行微滴化处理，利用油包水技术将其"分割"为数万个纳米级的微滴，每个微滴都是一个独立的 PCR反应体系。PCR扩增完成后，利用微滴读取仪逐个对微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为"1"，没有荧光信号的判读为"0"，根据泊松分布原理及阳性微滴的比例即可得出原始模板中目标片段的拷贝数，从而实现绝对定量 (Hikosaka et al., 2013)。
    由于所有微滴中的PCR反应都是独立进行的，相当于进行了几万次重复实验，因此可以排除绝大多数随机因素对PCR结果产生的影响，如酶的消耗、背景中大量的宿主DNA、血红蛋白和醇类等PCR抑制剂的影响。因此，与传统PCR相比，ddPCR不同批次间检测结果的差异大大降低，确保了实验的灵敏度和可重复性 (Koepfli et al., 2016)。此外，由于ddPCR采用泊松分析法而非根据荧光强度对模板进行定量，其结果几乎不受扩增效率的影响，对模板DNA浓度和质量的要求也较低。这种技术不仅能够检测含量极低的核酸序列（目标基因在总DNA中占比低至0.001%），而且无需标准品即可对目标片段进行绝对定量，灵敏度和精确性更高。
    本文所介绍的方法为可检测三个属血孢子虫的通用方法（图9），目标基因为血孢子虫线粒体基因组上的保守rRNA片段，能对感染强度低至10^-5 (每10⁵个宿主细胞中有1个被血孢子虫感染) 的样品进行精确定量 (Huang et al., 2020)，使不同实验室的研究结果比较成为可能，也为在大尺度上比较血孢子虫和宿主相互适应关系建立了基础。


图9. 数字式微滴PCR实验操作和原理示意图

材料与试剂

1. 移液器吸头 (Rainin，加利福利亚，美国，0.1-2.5 μl, 2-20 μl, 20-200 μl)
2. 1.5 ml离心管 (Eppendorf)
3. 50 ml试剂槽 (BBI，catalog number: F619711)
4. 普通96孔板 (Eppendorf)
5. 半裙边96孔微生物学板 (Bio-Rad，加利福利亚，美国，catalog number: 30129334)
6. 96孔板热封膜 (Bio-Rad，catalog number: 1814040)
7. 微滴发生卡 (Bio-Rad，catalog number: 1864008)
8. 微滴生成密封垫 (Bio-Rad，catalog number: 1863009)
9. EvaGreen 微滴发生油 (Bio-Rad，catalog number: 1863005)
10. EvaGreen ddPCR mix (Bio-Rad，catalog number: 1863010)
11. 引物1对 (3524F：5'-AGGCAAAGAAAATGACCGG-3'， 3655R：5'-ATGGCGAGAA GGGAAGTGTG-3')
    

仪器设备

1. 单道移液器 (Rainin，加利福利亚，美国，量程 0.1-2.5 μl, 2-20 μl, 20-200 μl)
2. 8道移液器 (Rainin，量程2-20 μl, 20-200 μl)
3. PX1热封仪 (Bio-Rad)
4. 循环变温加热器 (Bio-Rad)
5. QX200微滴生成仪 (Bio-Rad)
6. QX200微滴读取仪 (Bio-Rad)
   

软件

1. Quantasoft (Bio-Rad)

实验步骤

1. 样品准备
   
   1)

   将模板、引物和试剂置于冰上融化。
   2)

   在冰上配制反应体系预混液。计算反应所需的试剂体积，将EvaGreen、ddH₂O和引物在1.5 ml离心管中混合，振荡混匀，短暂离心收集管壁上液滴，完成无模板的预混液制备。使用96孔板时可以在条形试剂槽中混匀，用排枪上样。考虑到移液过程中的损失，预混液的总体积为 (单个反应体积) × (实际反应数 + 1)。单个反应体系为20 μl，根据待检测样品的数量，建议配制方法如表5所示。
   3)

   将移液器量程设置为18.18 μl，将无模板样品预混液分装至普通96孔板。(移液器排出溶液时只按至第1档，实际加样体积为18 μl)
   4)

   将移液器 (排枪) 量程设置为2.02 μl，向无模板样品预混液中加入模板溶液。 (移液器排出溶液时只按至第1档，实际加样体积为2 μl)。每轮反应中，每个样品均重复3次，建议每排为7个样品加一个阴性对照。阴性对照可采用确定未感染的样品，或以ddH₂O代替DNA模板。
   5)

   将96孔板放入离心机，配平后中速离心，确保样品管中没有气泡、管壁没有沾上液滴。如果无法立刻继续实验，可短暂存放于4 °C冰箱，但建议不超过24h。
   注意：有荧光染料，注意避光；合理使用移液器档位，将量程设置为略高于所需用量以减少操作性损失，加样时只按至第1档可减少气泡产生。
   
2. 生成微滴
   
   1)

   将移液器量程设置为20 μl，将反应溶液转移至微滴发生卡的中间孔。由于微滴发生卡为八联管形式，每次可转移一排样品。(移液器排出溶液时只按至第1档)
   2)

   将移液器量程设置为70 μl，向微滴发生卡的下排孔中加入微滴生成油。(由于油滴不会产生气泡，移液器排出溶液时按至第2档，将液体全部加入孔中)
   3)

   检查并排除气泡后，将微滴发生卡插入托架，套上密封垫，放入微滴生成仪，生成微滴。
   4)

   取出微滴发生卡，将8道移液器 (排枪) 量程设置为42 μl (增加2 μl保证吸取全部微滴产物)，将微滴生成卡上排孔中的微滴产物缓慢匀速转移至半裙边96孔板中，每个样品转移时间控制在30s至1min，尽量避免气泡的产生。96孔板置于冰盒上，并用普通封板膜 (光滑面在下) 盖住以避光。
   5)

   重复以上步骤，完成所有微滴产物的制备和转移。
3. 96孔板封膜
   
   1)

   点击PX1热封仪屏幕上的"向上箭头" (注意此时96孔板不要放在仪器前方)，将上述所得96孔板与专用金属板封板膜放入PX1热封仪中 (封板膜不能有折痕，且有红线的一面向上)，在此点击屏幕上的"向上箭头"，seal，扣紧，封板；水平旋转180°再封一次。
   2)

   点击180 °C，Off，待热封仪冷却至室温后再关机。生成微滴后尽快开始PCR反应，建议当天完成。
4. PCR扩增
   
   1)

   设置PCR程序， 94 °C 5 min → 35 cycles [ 94 °C 30 s → 57 °C 30 s → 72 °C 40 s ] → 72 °C 10 min → 4 °C hold [注：变温速率 (ramp rate) ≤ 2 °C /s；热盖温度105 °C；反应体系40 μl]。
   2)

   放入96孔板，盖上热盖并拧紧旋钮直至听到"嗒嗒"声，开始PCR。
5. 读取数据
   
   1)

   打开微滴读取仪。(开机顺序：电脑→微滴读取仪→QuantaSoft软件) 在PCR运行过程中，在QuantaSoft软件中设置微滴读取参数及样品信息。
   2)

   检查微滴读取仪的读取油和废油液面指示，如报警则更换相应的油瓶。
   3)

   确定微滴读取仪可正常工作，并做使用前维护。(如未使用时间超过一周，则先做"Prime"；每天实验前先做"Flush System")
   4)

   设置反应参数。Experiment：ABS; Supermix: QX200 ddPCR EvaGreen SuperMix; Target 1 Type: ch1 Unknow, Target 2: Unused; 将Target 1 Name改为引物名称 (3524F-3655R) ，点击Apply。
   5)

   设置每个孔的对应样品名称：Sample → Name。
   6)

   PCR结束后，尽快开始读取微滴数据，等待时间≤ 30min。

数据分析

1. 质量控制
   检查微滴分布图和对应直方图，根据阴性对照的微滴分布手动调整荧光强度阈值。非特异扩增产生的阳性微滴可能呈"雨滴"状分布于目标扩增产物下方，因此阈值应高于阴性对照的最高值以排除非特异扩增 (图10)。检查微滴数，理想微滴数应在15,000-20,000间（图11），读取微滴数低于一万的样品结果不可信。如果同一个样品的三个重复的微滴分布相差较大，则去除不一致的结果。
   
   
   图10. 数字式微滴PCR反应的微滴分布图。A03、D03为阳性样品，呈现阳性微滴和非特异扩增产生的“雨滴”；C10为阴性对照，呈现阴性微滴。由于阴性微滴的荧光信号极低，不同样品中阴性微滴的位置可能存在一定差异，但一般位于10,000附近。阈值应高于阴性微滴和雨滴位置。微滴数目用不同颜色标明，蓝色为较少，红色为较多，黄色为极多。
   
   
   图11. 数字式微滴PCR反应的微滴直方图，显示可读取的微滴数量。每个反应孔中微滴的理论数量约为20,000，如果可读取微滴数低于10,000则结果不可信，需重复实验。
   
   
2. 导出结果
   
   1)

   确定结果可信后，软件会自动计算每个样品中的目标片段拷贝数，将其导出至Excel文件，根据反应体系中加入的DNA模板体积 (2 μl) 即可得到原始模板中血孢子虫的数量 (Q寄生虫)。
   2)

   宿主红细胞个数 (Q宿主) 可沿用第二章qPCR中的引物SFSR/3Fb -SFSR/3Rb，用ddPCR方法检测，方法与血孢子虫检测方法相同。结合血孢子虫和宿主的定量检测结果，感染强度为。

竞争性利益声明

无经济或非经济性竞争性利益。

伦理学声明

采样和实验均获得北京师范大学生命科学学院批准。
批准文号：No. CLS-EAW-2013-007

致谢

实验方案摘自文章A new protocol for absolute quantification of haemosporidian parasites in raptors and comparison with current assays(Huang et al., 2020).

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