摘要:新生RNA可与DNA通过碱基互补配对形成一种高度动态的三链核酸结构,称为R-loop。R-loop参与多种生命活动过程,包括DNA复制、基因转录、DNA损伤修复和表观遗传修饰调控等。R-loop失调会破坏基因组稳定性,干扰基因表达调控,诱发细胞病变和疾病发生。因此了解全基因组中R-loop的分布,将非常有助于解答R-loop在细胞病变和疾病发生中的作用。为绘制R-loop的全基因组图谱,我们在细胞中过表达切割酶活性缺失的RNase H1突变体,并通过染色质免疫共沉淀技术和链特异性单链DNA文库建立方法,实现在细胞体内对R-loop的定位和相对定量分析。我们将该方法命名为R-ChIP (Chen et al., 2019)。该方法不同于以往依赖S9.6抗体的DRIP-seq、DRIPc-seq、ssDRIP-seq等,可以较为真实的反映体内R-loop水平,并且超声片段化的方式使文库的分辨率提高到200-300 bp,优于普通DRIP-seq分辨率。
关键词: R-loop, 染色质免疫共沉淀技术, RNase H1, 高通量测序
研究背景
R-loop是转录过程中新生RNA链与模板DNA链退火形成的杂合链结构与非模板DNA链共同形成的三链结构。此结构广泛存在于细菌、真菌和动植物基因组中,参与众多生理学过程。例如脊椎动物B细胞的免疫球蛋白类别转换重组 (CSR) (Yu et al., 2003),CRISPR-Cas9基因编辑 (Jinek et al., 2012),或者线粒体DNA、细菌和噬菌体的ColE1和T4复制起始、以及转录起始和终止等过程。目前领域认为R-loop富集在基因转录的起始区域和终止区 (Aguilera and Garcia-Muse, 2012)。除上述生理性R-loop,还存在着非程序性调控的病理性R-loop,它们会对基因组的稳定性造成了巨大的破坏,例如敲低细胞剪切复合物成员OCMG1会导致R-loop失调并诱发DNA双链断裂 (DSB),γH2AX荧光信号显示DNA损伤和复制叉阻遏相关,重要的是过表达RNase H会抑制γH2AX聚集 (Houlard et al., 2011),此外R-loop还会导致转录复制冲突 (Boubakri et al., 2010),这些结果显示转录会通过R-loop影响双链断裂 (DSB) 修复等。因此准确定位基因组中R-loop,了解R-loop在不同环境和细胞周期条件下与转录、复制和表观特征等过程关联的分子基础,将有助于我们更好理解染色质功能调控对基因组稳定性维持和疾病发生的重要作用。
现阶段定位基因组中R-loop的方法主要是依赖S9.6抗体的DRIP-seq以及多种衍生技术 (Xu et al., 2017)。该类方法的原理是利用S9.6抗体特异性识别R-loop的特性,在体外富集限制酶消化后的基因组片段,并对富集到的R-loop结构进行建库及高通量测序。由于采用限制酶对DNA进行片段化,DRIP-seq信号范围在5 kb左右,分辨率较低,不能精确定位R-loop的分布;并且越来越多文献报道S9.6抗体不仅可以识别杂合链结构,还可以非特异性结合双链RNA结构,从而会造成文库信息不准确等问题。基于以上问题,我们利用不同原理开发了新的基因组R-loop定位技术。RNase H1蛋白是哺乳动物中重要的R-loop调控蛋白,由N端杂合链结合结构域 (HBD) 和C端内切酶基序组成,可以降解杂合链结构中的RNA链,调节体内R-loop动态。研究表明RNase H1 第210位的天冬氨酸 (D) 突变为天冬酰胺 (N) 可以使酶活性丧失,但是不改变其与底物结合能力,因此可以作为杂合链靶向蛋白。R-ChIP便是通过在体内过表达RNase H1 D210N突变体,由其靶向杂合链结构,再利用超声的方法进行片段化,然后富集RNase H1结合序列,对其进行链特异性建库 (Chen et al., 2017)。该方法相较于依赖S9.6抗体建库的方法更加真实的反映了体内R-loop的分布,将分辨率提高到200-300 bp,并且链特异性建库的方法可以获得链方向性的信息从而判断转录方向。但是体内过表达RNase H1可能在一定程度上影响细胞内R-loop稳态,并且对于组织中的应用需要先建立转基因模型,因此需要根据实验需求选择合适的方法。
材料与试剂
- PpyCAG-RNaseH1-D210N (Addgene, catalog number: 111904)
- 甲醛 (Sigma-Aldrich, catalog number: 252549-100ML)
- 甘氨酸 (Sigma-Aldrich, catalog number: G7126-500G)
- Lipo2000 (Thermo Fisher, catalog number: 11668-030)
- 潮霉素B (Thermo Fisher, catalog number: 10687010)
- RNase A (Thermo Fisher, catalog number: EN0531)
- 蛋白酶K (New England Biolabs, catalog number: P8107S)
- DNA提取酚 (Solarbio, catalog number: T0250)
- DNA提取试剂 (25:24:1, pH 8.0, Solarbio, P1012)
- 蛋白酶抑制剂 (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma, catalog number: S8830-20TAB)
- Deoxycholate (Sigma-Aldrich, catalog number: D6750-25G)
- Glycogen (Thermo Fisher, catalog number: FERR0561)
- Protein A/G磁珠 (Thermo Fisher, catalog number: PI88802)
- V5抗体 (ChIP Grade, Abcam, catalog number: ab9116)
- RNA酶抑制剂 (Thermo Fisher, catalog number: FEREO0382)
- Klenow DNA polymerase (New England Biolabs, catalog number: M0210S)
- Klenow fragment 3'-5' exo- (New England Biolabs, catalog number: M0212S)
- 3'Random N9 primer/OligoA/OligoB (Takara)
N9 random primer:5ʹ-/invddt/CAAGCAGAAGACGGCAT ACGAGNN NNNNNNN-3ʹ;
Oligo A:5ʹ-/Phos/GATCGGAAGAGCGTC GTGTAGGGAAAGAGTGT-3ʹ;
Oligo B:5ʹ-AGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3ʹ; - PCR文库扩增引物
Primer F:5ʹ-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG -3ʹ
Primer R:5ʹ-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNACACTCTT TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3ʹ (NNNNNN为barcode序列) - PureLink PCR Micro Kit (Thermo Fisher, catalog number: K310050)
- Phase-block gel tube-light (Tiangen, catalog number: WM5-2302820)
- dATP (New England Biolabs, catalog number: N0440S)
- dNTP (New England Biolabs, catalog number: N0447S)
- T4 DNA ligase (New England Biolabs, catalog number: M0202S)
- Phusion DNA polymerase (New England Biolabs, catalog number: M0530S)
- PureLink Quick Gel Extraction Kit (Thermo Fisher, catalog number: K210012)
- Beads wash buffer (见溶液配方)
- Antibody binding buffer (见溶液配方)
- Beads blocking buffer (见溶液配方)
- Cell lysis buffer (见溶液配方)
- Nuclear extract buffer (见溶液配方)
- TE buffer (见溶液配方)
- Elution buffer (见溶液配方)
- Wash buffer I (见溶液配方)
- Wash buffer II (见溶液配方)
- Wash buffer III (见溶液配方)
- Annealing buffer (见溶液配方)
仪器设备
- 移液枪 (Rainin, catalog number: 17014388, 17014391, 17014382)
- 恒温混匀仪 (Eppendorf, ThermoMixer C, catalog number: 5382000023)
- 超声破碎仪 (Bioruptor Plus; Diagenode, model no. B01020001)
- 冷冻离心机 (Eppendorf, model no. 5804R)
- -80 °C冰箱 (FORMA 900 series, Thermo Fisher, model no. 989)
- -20 °C冰箱 (Panasonic, Model no. BZ10145190)
- 旋转摇床 (BenchRocker 2D Rocker; Benchmark Scientific, model no. BR2000)
- 金属浴锅 (上海一恒, catalog number: BWS-20)
- 电泳仪及电源 (六一DYY-6C/7C/8C高压双稳定时电泳仪)
- 磁力分离架 (Monad, model no. GS50401)
- Qubit荧光光度计 (Thermo Fisher, model no. Q32857)
实验步骤
- 构建NLS-RNaseH1(D210N)-V5稳转细胞系。当24孔板内的293T细胞生长至70%密度时,每孔转染500 ng PpyCAG-RNaseH1-D210N质粒。48 h后加入200 ng/ul潮霉素B筛选15 d,获得NLS-RNaseH1(D210N)-V5稳转细胞系。进行蛋白免疫印迹实验验证NLS-RNaseH1(D210N)-V5的表达情况。
图1. 建立RNaseH1-V5稳定表达细胞的western blot检验
- 孵育抗体与磁珠。每份细胞样品需要用到25 μl的Protein A/G磁珠,一个1.5 ml离心管内可处理100 μl。使用1 ml beads wash buffer清洗beads,室温摇洗5 min,利用磁力分离架分离除去beads wash buffer,重复清洗3次。加入1 ml beads blocking buffer,置于旋转摇床室温孵育1 h。使用1 ml antibody binding buffer清洗磁珠三次,室温条件下每次摇洗5 min。按每个样品对应2.5 μg V5抗体的用量,将抗体加入到400 μl beads binding buffer中,混匀后充分重悬磁珠,于4 °C缓慢旋转孵育过夜。
- 细胞交联。当10 cm培养皿内细胞密度达到70-80%取出置于冰上,用预冷的PBS buffer清洗三次,加入10 ml PBS buffer,随后逐滴加入270 μl 36.5-38%甲醛,边加边摇晃混匀,终浓度为1%。将培养皿置于水平摇床上,在50 r/min的条件下室温交联10 min。加入1 ml 1.375 M甘氨酸终止交联,继续摆动孵育15 min。用细胞刮刮下细胞,于4 °C 800 × g 转速离心5 min,去上清。用10 ml预冷的PBS buffer重悬细胞,于4 °C 800 × g 转速离心5 min,除去上清,重复清洗两次。细胞沉淀可继续进行下一步核质分离或于-80 °C保存。
注:甲醛具有强烈毒性,易挥发,应做好防护,在通风橱中操作,其交联废液应妥善处理。
- 核质分离。 加入1 ml Cell lysis buffer,充分悬浮细胞,避免气泡。冰浴15 min,每2-3 min颠倒混匀一次。于4 °C 700 × g转速离心5 min,除去上清。此时细胞沉淀变得透明,体积变大。加入1 ml Cell lysis buffer,充分悬浮细胞,于4 °C 700 × g转速离心5 min,除去上清。
- 超声破碎。提前预冷超声波破碎仪至4 °C。加入500 μl Nuclear extract buffer,充分悬浮细胞,避免气泡。冰浴10 min,混匀后放入超声波破碎仪中,高功率破碎25次,每次工作30 s/间歇30 s,每超声5次将样品拿出来吹打混匀,避免产生气泡,以保证染色质片段的均一性。超声破碎结束后,将样品置于冰上0.5-2 h,此时样品有沉淀析出。于4 °C 16,000 × g转速离心10 min,转移上清至新离心管。
- 检测超声破碎效果。取10 μl 上清,加入90 μl TE buffer,1 μl RNase A (10 mg/ml),于恒温混匀仪中37 °C孵育1 h (1000 rpm,震荡30 s/间歇2 min)。加入1 μl Proteinase K (20 mg/ml),继续于65 °C孵育2 h。孵育结束后,加入300 μl DNA提取酚,充分震荡混匀,转移到Phase-block gel tube-light (已预离心) 中,于4 °C 16,000 × g转速离心5 min。取上层溶液至新的离心管,加入300 μl DNA提取试剂,充分吹吸均匀后将混合液全部移回至原Phase-block gel tube-light 中,于4 °C 16,000 × g转速离心5 min,重复DNA提取试剂提纯一次。转移约300 μl上清至新的离心管,加入1 μl Glycogen,30 μl 3 M NaAc (pH 5.5),混匀后加入750 μl预冷无水乙醇,颠倒试管数次混匀后置于-80 °C冰箱沉淀30 min。结束后样品于4 °C 16,000 × g转速离心15 min。吸去上清后,用70%预冷乙醇洗涤沉淀,于4 °C 16,000 × g转速离心15 min。吸去上清并于室温晾干10 min后用25 μl 超纯水溶解沉淀。提纯后的DNA样本用2%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。
注:合适片段大小应为150-600 bp,主带在200-400 bp左右。
图2. K562细胞超声30 min 片段大小分布在100-400 bp
- 免疫共沉淀。步骤5得到的上清用Nanodrop A280测定蛋白浓度,并用TE buffer将不同样品的蛋白浓度调至一致。每个样品取500 μl上清,加入644 μl TE buffer,130 μl 10% Triton X-100,13 μl 10% Deoxycholate,13 μl 100x蛋白酶抑制剂,0.5 μl RNA酶抑制剂。取65 μl移至新离心管作为Input DNA,加入85 μl Elution buffer,于-80 °C保存。将步骤2中的含磁珠离心管置于磁力分离架上,除去上清。加入超声破碎产物重悬磁珠,于4 °C缓慢旋转过夜。
- 清洗磁珠和洗脱抗体结合产物。将孵育过夜的离心管4 °C短暂离心,置于磁力分离架上,除去上清。加入1 ml Wash buffer I,吹打30次,于4 °C轻微旋转3 min后置于磁力分离架上,除去上清。共重复清洗三次,并在最后一次清洗中更换新离心管。加入1 ml Wash buffer II,吹打30次,于4 °C轻微旋转2 min后静置于磁力分离架上,除去上清。共重复清洗三次,并在最后一次清洗中更换新离心管。加入1 ml Wash buffer III,吹打30次,于4 °C旋转3 min后换管并静置于磁力分离架上,除去上清。加入1 ml TE buffer,吹打30次,于4 °C轻微旋转3 min后换管并静置于磁力分离架上,除去上清。样品于4 °C 短暂离心后,后置于磁力分离架上,充分去除残留上清。最后加入170 μl Elution buffer,于65 °C孵育30 min (1200 rpm,工作30 s/间歇2 min)。最大转速短暂离心,取上清即为IP DNA。
- 解交联。将步骤7中的Input DNA和IP DNA 65 °C孵育过夜 (1200 rpm,工作30 s/间歇2 min)。加入150 μl TE buffer,6 μl RNase A,37 °C孵育2 h。加入7 μl Proteinase K和1.5 μl Glycogen,50 °C继续孵育2 h。
- 回收DNA。加入300 μl DNA提取酚,混匀充分,转移至新的light phase-lock gel tube,于4 °C 16,000 × g转速离心5 min。取上清并加入300 μl DNA提取液(25:24:1),混匀充分后转移至原light phase-lock gel tube,于4 °C 16,000 × g转速离心5 min。重复DNA提取液提纯一次。转移约300 μl上清至新的离心管,加入30 μl 3 M NaAc (pH 5.5),1 μl Glycogen,混匀后加入750 μl预冷无水乙醇,置于-80 °C冰箱沉淀30 min。于4 °C 16,000 × g转速离心15 min。去除上清后加入70%预冷乙醇洗涤沉淀,于4 °C 16,000 × g转速离心5 min。去除上清后,将离心管于室温晾干10 min,25 μl 超纯水溶解沉淀。定量PCR验证已知R-loop富集区域,查看免疫沉淀效果。
图3. 293t细胞富集R-loop的R-ChIP-qPCR信号
表1. R-ChIP-qPCR所用引物序列
引物名称 | 序列信息 |
Intergenic F | TCACCCAGCTGTGGTTTACA |
Intergenic R | CTGCCTCAGACTTCCAAAGG |
JUN-TSS F | GGGTGACATCATGGGCTATT |
JUN-TSS R | TCGGACTATACTGCCGACCT |
JUN-TTS F | AAATAAGCAGGCTGGGGAAT |
JUN-TTS R | CAATCAAGCATGGGGATAGG |
NEAT1-TSS F | TAGTTGTGGGGGAGGAAGTG |
NEAT1-TSS R | ACCCTGCGGATATTTTCCAT |
NEAT1-TTS F | AGAGGGAGGGAGAGCTGAAG |
NEAT1-TTS R | GCATGAAGTCAGACCAGCAA |
LENG8-TSS F | CGCACTTACGCATGAACATT |
LENG8-TSS R | AGACTCCGTCTCCGAGAACA |
LENG8-TTS F | AGGCACTGTGCTGAGGAAAT |
LENG8-TTS R | GCGGAAGCTATGGAGACAAG |
- 随机引物延伸。分别取19 μl免疫沉淀回收的DNA片段和19 ul 4倍稀释的input DNA,加入2.5 μl 10x NEB buffer,1 μl 10 mM dNTP和1 μl 20 μM N9 primer混合后,于95 °C变性5 min,25 °C孵育5 min。加入1.5 μl Klenow DNA polymerase,于30 °C孵育30 min,接着于75 °C孵育10min失活聚合酶。使用PureLink PCR Micro Kit回收DNA并用13 μl 超纯水洗脱2次,共25 μl。
- 3'端dA加尾。在25 μl洗脱DNA溶液中加入3 μl 10x NEB buffer2,1 μl 10 mM dATP和1 μl Klenow fragment 3'-5' exo-。混匀后于37 °C孵育30 min。使用PureLink PCR Micro Kit回收DNA并用7 μl 超纯水洗脱2次,共13 μl。
- Adaptor退火。用合适量的annealing buffer稀释Oligo A和Oligo B至40 μM。分别取25 μl于PCR管中,95 °C 2 min,0.1 °C/s退火至10 °C,25 °C保存。将退好火的adaptor分装后-20 °C保存,避免反复冻融。
- Adaptor连接。取5 μl 20 μM adaptor,加入45 μl 超纯水,终浓度为2 μM。将13 μl 加尾后的DNA,2 μl 10x T4 ligase buffer,1 μl 2 μM adaptor和4 μl T4 DNA ligase混合后于25 °C孵育2-4 h。
- PCR文库扩增。将20 μl 连接产物DNA,6 μl 5x HF buffer,1 μl 10 mM dNTPs,1 μl 10 μM primer-F,1 μl 10 μM primer-R,0.5 μl DMSO和1 μl Phusion HF DNA polymerase充分混合并进行PCR扩增,条件如下:98 °C 30 s,14-16 cycles (98 °C 10 s,65 °C 30 s,72 °C 30 s),72 °C 5 min。
- 文库回收。使用2%琼脂糖胶回收DNA文库,按照插入片段40-300 bp计算回收DNA片段长短,将合适范围的DNA片段切下并使用PureLink Quick Gel Extraction Kit回收。使用Qubit荧光光度计测定回收产物浓度,于-80 °C冰箱保存,用于后续二代测序。
溶液配方
- Beads wash buffer
20 mM Tris (pH 8.0)
150 mM NaCl
2 mM EDTA
1% Triton X-100 - Antibody binding buffer
5 mg/ml BSA in PBS - Beads blocking buffer
1 ml beads wash buffer
20 μl antibody binding buffer
现配现用,现加200 ng/ml yeast RNA - Cell lysis buffer
10 mM Tris (pH 8.0)
10 mM NaCl
0.5% NP40
临用前加1x 蛋白酶抑制剂 - Nuclear extract buffer
50 mM Tris (pH 8.0)
10 mM EDTA
1% SDS - TE buffer
10 mM Tris (pH 8.0)
1 mM EDTA - Elution buffer
10 mM Tris (pH 8.0)
1 mM EDTA
1% SDS - Wash buffer I
20 mM Tris (pH 8.0)
150 mM NaCl
2 mM EDTA
1% Triton X-100
0.1% SDS
临用前加1x 蛋白酶抑制剂 - Wash buffer II
20 mM Tris (pH 8.0)
500 mM NaCl
2 mM EDTA
1% Triton X-100
0.1% SDS
临用前加1x 蛋白酶抑制剂 - Wash buffer III
10 mM Tris (pH 8.0)
1 mM EDTA
1% NP40
1% Deoxycholate
250 mM LiCl
临用前加1x 蛋白酶抑制剂 - Annealing buffer
10 mM Tris (pH 8.0)
50 mM NaCl
1 mM EDTA
注:所有溶液均用0.45 μm滤器过滤,可4 °C长期保存。
参考文献
- Chen, J. Y., Zhang, X., Fu, X. D. and Chen, L. (2019). R-ChIP for genome-wide mapping of R-loops by using catalytically inactive RNASEH1. Nat Protoc 14(5): 1661-1685.
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- Aguilera, A. and Garcia-Muse, T. (2012). R loops: from transcription byproducts to threats to genome stability. Mol Cell 46(2): 115-124.
- Houlard, M., Artus, J., Léguillier, T., Vandormael-Pournin, S. and Cohen-Tannoudji, M. (2011). DNA-RNA hybrids contribute to the replication dependent genomic instability induced by Omcg1 deficiency. Cell Cycle 10(1): 108-117.
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- Chen, L., Chen, J. Y., Zhang, X., Gu, Y., Xiao, R., Shao, C. W., Tang, P., Qian, H., Luo, D., Li, H., Zhou, Y., Zhang, D. E. and Fu, X. D. (2017). R-ChIP Using Inactive RNase H Reveals Dynamic Coupling of R-loops with Transcriptional Pausing at Gene Promoters. Mol Cell 68(4): 745-757 e5.
Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:江翱, 张显红, 周宇, 陈加余, 陈亮. (2022). R-ChIP: 利用失活RNase H1来构建全基因组范围内 R-loop图谱的文库.
Bio-101: e1010803. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010803.
How to cite: Jiang, A., Zhang, X. H., Zhou, Y., Chen, J. Y. and Chen, L. (2022). R-ChIP: Genome-wide Mapping of R-loops by Using Inactive RNase H.
Bio-101: e1010803. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010803.