利用体外合成带生物素标记的RNA富集细胞裂解液 中与之互作的蛋白的方法
A Method for Purifying RNA Interacting Proteins from Cell Lysates by Using in vitro Synthesized Biotin-labeled RNA   

研究背景

随着对RNA功能研究的深入，人们发现许多RNA通过结合特定的蛋白质并影响其结构和功能来发挥作用。所以，鉴定RNA结合蛋白能够帮助我们更好地研究RNA的功能。目前，常用的鉴定RNA结合蛋白的方法有RNA pull down、ChIRP (Chromatin Immunoprecipitation by RNA Purification) (Chu et al., 2012)、dChIRP (domain-specific chromatin isolation by RNA purification) (Quinn et al., 2014) 等技术，其中，RNA pull down技术的应用最为广泛。RNA pull down实验首先将体外合成带有生物素标记的RNA与细胞裂解液进行孵育，接着用链霉亲和素磁珠富集生物素标记的RNA，同时获得RNA-靶蛋白复合体。最后通过质谱或Western Blot等蛋白质鉴定方法，我们就可以确定该RNA的结合蛋白。和其他技术相比，RNA pull down技术操作简单、耗时短、花费少，因此被广泛使用。掌握RNA pull down实验技术，可以帮助我们更好地研究RNA的功能。本文结合本实验室已发表的文章，详细阐述RNA pull down实验的操作过程与结果分析 (Wang et al., 2021)。

材料与试剂

1. 移液器枪头 (DNase free，RNase free) 
2. 1.5 ml EP管
3. 100 mm细胞培养皿
4. 冰盒
5. 200 µl PCR管 (QSP，catalog number: 431-Q) 
6. 链霉亲和素磁珠 (Pierce，catalog number: 88817)
7. T7 RNA Polymerase Riboprobe® Systems (Promega，catalog number: P1440) 
8. Biotin-16-UTP (Roche，catalog number: 11388908910) 
9. 生物素 (thermo，catalog number: B20656) 
10. Tris-HCl (pH = 7.5，thermo，catalog number: 15567027) 
11. NaCl (国药，catalog number: 10019318) 
12. SDS (Macklin，catalog number: S817788-500G) 
13. NP-40 (Macklin，catalog number: N885725-100 ml) 
14. tRNA (Invitrogen，catalog number: AM7119) 
15. HEPES (Amresco，catalog number: 0485-25G) 
16. EDTA (Amresco，catalog number: 0322-1KG) 
17. Sarkosyl (Macklin，catalog number: D885916-100 ml) 
18. 脱氧胆酸钠 (国药，catalog number: 69022780) 
19. DTT (Amresco，catalog number: 0281) 
20. Protease inhibitor cocktail (Amresco，catalog number: M221-1ML) 
21. RNasin ribonuclease inhibitor (Promega，catalog number: N2511) 
22. BSA (Sigma，catalog number: A1470-25G) 
23. 1x PBS缓冲液 (Hyclone，catalog number: SH30256.01) 
24. PMSF (碧云天，catalog number: ST506) 
25. UltraPure^TM DNase/RNase-Free Distilled Water，超纯水 (Invitrogen，catalog number: 10977023) 
26. RNase喷雾清除剂 (Vazyme，catalog number: R504-01) 
27. LDHA一抗 (Sigma, catalog number: ab14123)
28. 5x RIP缓冲液 (见溶液配方) 
29. 细胞裂解缓冲液 (见溶液配方) 
30. 生物素洗脱液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液器
2. 磁力架
3. 水浴锅
4. 4 °C冰箱
5. -80 °C冰箱
6. 恒温金属浴震荡仪
7. 4 °C离心机
8. Nanodrop分光光度计
   

实验步骤

一、体外转录带生物素标记的RNA (以已发表文章中LINC00973为例)

1. 设计靶向目的RNA LINC00973的PCR引物，以MDA-MB-231-LM2细胞的cDNA为模板，克隆得到RNA LINC00973的全长DNA片段。
2. 利用PCR技术在LINC00973 DNA片段起始端添加一段T7启动子片段，然后扩增得到带有T7启动子的LINC00973 DNA片段。 (T7启动子是体外RNA合成酶T7 Polymerase识别和结合的区域。当T7 Polymerase结合到LINC00973前的T7 启动子区，就能启动转录，转录出LINC00973 RNA。) 
3. 取1个200 µl PCR管，加入0.5 µg带T7启动子的LINC00973 DNA片段模板，配制体外转录体系，如表1所示。
   
   表1. RNA体外转录体系
   

   Transcription Optimized 5x Buffer	10 µl
   DTT, 100 mM	5 µl
   Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor	1.25 µl
   rNTP (rATP+rCTP+rGTP), 100 mM	7.5 µl
   rUTP, 100 mM	1.876 µl
   Biotin-16-UTP，100 mM	0.124 µl
   T7 Polymerase, 80 U/µl	0.25 µl
   带T7启动子LINC00973 DNA片段模板	0.5 µg
   Nuclease free H2O	加至总体积为50 µl

   
   
   
4. 将配置好的RNA体外转录体系放入PCR仪中，37 °C反应8 h或过夜。
5. 反应完成后，用TRIzol法 (Donald et al., 2010) 纯化体外合成的RNA，用Nanodrop分光光度计测量产物浓度。利用RNA分子量计算工具 (如Oligo Calc，http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html) 获取RNA的分子量，根据分子量我们便可以进一步换算出转录产物的摩尔浓度。如果不能马上进行下面的步骤，要将体外转录RNA放到-80 °C冰箱保存。

二、其他材料准备

1. 用100 mm细胞培养皿培养MDA-MB-231-LM2细胞。待细胞铺满约80%培养皿底部时，移除培养基，用PBS洗涤细胞两次，再用5%胰酶消化细胞，用培养基重悬，进行细胞计数。
2. 收集约2 x 10⁷个细胞，置于离心机中以100 × g转速离心5 min去除培养基，再用1 ml PBS轻轻重悬细胞，置于离心机中以100 × g转速离心5 min去除培养基。向EP管中的细胞沉淀加入300 μl细胞裂解缓冲液，用移液枪轻轻吹打混匀后，于4 °C，10 rpm条件下在旋转混匀仪上摇晃裂解30 min。最后将样品放至4 °C预冷的离心机中 13,000 × g离心15 min收取上清。
3. 取50 µl链霉亲和素磁珠，用1 ml 1x RIP缓冲液洗涤两次，然后用50 µl 1x RIP缓冲液重悬磁珠。
4. 将洗涤后的磁珠加入到细胞裂解液中，在4 °C条件下摇晃孵育2 h，然后将装有细胞裂解液的EP管置于磁力架上，待磁珠都被磁铁吸附到一起、管中液体变得澄清后，小心地将上清吸取至新的EP管中，重新加入洗涤后磁珠吸附取上清1次。该步骤的目的是去除细胞裂解液中能够直接结合磁珠的蛋白，避免干扰实验结果。取50 µl细胞裂解液上清液作为Input组保存于-80 °C，剩下的用于接下来的RNA结合实验。
5. 体外转录RNA复性：取50 pmol体外转录得到的带有生物素标记的LINC00973 RNA (稀释至终体积约10-50 µl即可) 于 200 µl PCR管中，在65 °C水浴锅中加 热5 min，然后关闭水浴锅，让水温慢慢降至室温 (一般约15-25 min)。随后将装有RNA样品的PCR管低速离心使壁上的冷凝水回到管底，再将样品放置在冰盒上备用。

三、体外转录RNA与蛋白质共同孵育

1. 将复性后的RNA加入到250 µl磁珠处理后的细胞裂解液上清中作为实验组，另外可以多设一组阴性对照组，不加RNA到细胞裂解液中。两组样品均加入tRNA使其终浓度为20 µg/ml，在4 °C条件下过夜摇晃孵育。
2. 取25 µl链霉亲和素磁珠，用1 ml 1x RIP缓冲液洗涤两次，然后用20 µl 1x RIP缓冲液重悬，加入BSA使其质量百分比浓度为1%，在4 °C条件下，将磁珠置于旋转混匀仪上以10 rpm转速摇晃封闭2 h，然后通过磁力架吸附去除液体。
3. 将步骤1孵育好的RNA-细胞裂解液混合物转移到步骤2封闭好的磁珠中，轻轻吹打重悬磁珠，在4 °C条件下将样品置于旋转混匀仪上以10 rpm转速摇晃孵育2 h。阴性对照组也采取同样处理。
4. 用5x RIP缓冲液 (需要额外添加蛋白酶抑制剂和RNase抑制剂：1x Protease inhibitor cocktail，25 U/ml RNasin ribonuclease inhibitor) 对磁珠进行洗涤，洗 涤4次，每次在旋转混匀仪上4 °C、10 rpm摇晃5 min。再用细胞裂解缓冲液洗涤4次，同样每次在旋转混匀仪上4 °C、10 rpm摇晃5 min。
5. 向磁珠中加入50 µl生物素洗脱液，放置在恒温金属浴震荡仪上，37 °C、800 rpm条件下反应30 min，然后用磁力架吸附磁珠收集上清。RNA结合的蛋白就在上清液中。

四、Western blot实验验证RNA与蛋白质的相互作用

1. 用BCA法测量实验组和阴性对照组的input组的蛋白浓度 (实验组和阴性对照组通过RNA富集的含有靶蛋白上清液组，正常情况下，蛋白浓度极低，无需测量)。
2. 将实验组和阴性对照组的input各取10 µg用于western blot实验。实验组和阴性对照组RNA pull down 的含有靶蛋白上清液的上样量按照各自input的体积的1/5 (每组原本250 µl的细胞裂解液用于pull down实验，最后用50 µl生物素洗脱液洗脱，相当于浓缩了5倍，故上清液的上样体积为input的1/5)。用LDHA抗体和用作对照的TXN抗体检测各组样品中的LDHA和TXN蛋白的含量。

结果分析

Western blot的结果如图1所示，实验组 (LINC00973) 和阴性对照组 (mock) 的input中均检测出LDHA和TXN的存在，说明细胞中表达LDHA和TXN。实验组的LINC00973 pull down的上清中可以检测到LDHA蛋白，不能检测到TXN蛋白，而阴性对照组里两种蛋白都不能检测到。这说明我们利用体外合成的RNA LINC00973能够特异性地结合LDHA蛋白，不能结合到TXN蛋白，且阴性对照组的结果排除了磁珠直接结合LDHA蛋白的可能性。所以，我们利用RNA pull down技术，成功证明了在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231-LM2中，RNA LINC00973能够特异性地与LDHA蛋白结合。这为我们研究RNA LINC00973的功能指明了方向。


图1. Western blot实验结果证实LINC00973能够特异性结合LDHA蛋白 (Wang et al., 2021)

注意事项

1. 实验操作过程要注意防止RNA的降解，所有实验用品都要保证没有DNase和RNase；实验操作前最好用RNase喷雾清除剂擦拭手套、实验台、移液器、冰盒等需用到的材料和器械。
2. 在操作过程中要注意穿戴好干净的口罩、手套、实验服等，避免杂质掉落到裂解液中，导致质谱检测分析中出现大量的角蛋白污染。
3. 体外转录获得的RNA由于经过提纯等步骤，部分RNA的结构状态可能发生变化。而RNA与靶蛋白质的相互作用时，很大程度上依赖于RNA的正确的结构状态，所以在进行RNA与蛋白孵育前，须先经过RNA复性这一步。先在65 °C水浴锅中加热5 min，打破碱基的互补配对从而破坏RNA的折叠结构，使得RNA形成单链的状态；关闭水浴锅后，让水温慢慢降至室温，在该过程中，可以让RNA充分折叠恢复正确的结构。
   

溶液配方

所有溶液配制中用到的水都是超纯水

1.  5x RIP缓冲液
   125 mM Tris-HCl (pH = 7.5)
   500 mM NaCl
   2.5% NP-40
2. 细胞裂解缓冲液
   1x RIP缓冲液 (5x RIP缓冲液稀释5倍)
   1 mM DTT
   1 mM PMSF
   1x Protease inhibitor cocktail
   25 U/ml RNasin ribonuclease inhibitor
3. 生物素洗脱液
   100 mM HEPES (pH = 7.5)
   500 mM NaCl
   1.5 mM EDTA
   12.5 mM D-biotin
   1% SDS
   0.1% Sarkosyl
   0.02% sodium deoxycholate
   

参考文献

1. Chu, C., Quinn, J. and Chang, H. Y. (2012). Chromatin isolation by RNA purification (ChIRP). J Vis Exp (61): 1-6.
2. Guo, C. J., Ma, X. K., Xing, Y. H., Zheng, C. C., Xu, Y. F., Shan, L., Zhang, J., Wang, S., Wang, Y., Carmichael, G. G., Yang, L. and Chen, L. L. (2020). Distinct processing of lncRNAs contributes to non-conserved functions in Stem Cells. Cell 181(3): 621-636.
3. Kligun, E. and Mandel-Gutfreund, Y. (2015). The role of RNA conformation in RNA-protein recognition. RNA Biol 12(7): 720-727.
4. Marin-Bejar, O. and Huarte, M. (2015). RNA pulldown protocol for in vitro detection and identification of RNA-associated proteins. Methods Mol Biol 1206: 87-95.
5. Quinn, J. J., Ilik, I. A., Qu, K., Georgiev, P., Chu, C., Akhtar, A. and Chang, H. Y. (2014). Revealing long noncoding RNA architecture and functions using domain-specific chromatin isolation by RNA purification. Nat Biotechnol 32(9): 933-940.
6. Wang, H., Lin, K., Zhu, L., Zhang, S., Li, L., Liao, Y., Zhang, B., Yang, M., Liu, X., Li, L., Li, S., Yang, L., Wang, H., Wang, Q., Li, H., Fu, S., Zhang, X., Jiang, P., CliffZhang, Q., Cheng, J. and Wang, D. (2021). Oncogenic lncRNA LINC00973 promotes Warburg effect by enhancing LDHA enzyme activity. Science Bulletin. (in press).