摘要:RIP (RNA Immunoprecipitation,RNA免疫沉淀) 技术,是研究细胞内RNA与蛋白质结合情况的一种技术,运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化获得结合在蛋白复合物上的RNA。结合的RNA序列可通过microarray、RT-qPCR或高通量测序鉴定。RIP技术不同于ChIP技术,它是研究目的蛋白和 RNA 分子间物理结合的一种方法。根据实验样品是否交联,将该技术分为两大类:天然RIP (Native RNA Immunoprecipitation) 和交联RIP (Cross-linked RNA Immunoprecipitation)。该方法简单易操作,结合RNA pull-down实验可以正向和反向的验证RNA-蛋白质之间的相互作用。
关键词: RNA蛋白质结合, 免疫沉淀, RNA分离纯化
材料与试剂
- 1.5 ml离心管 (上海生工生物,catalog number: F601620-9001)
- 2 ml RNase-free离心管 (生工,catalog number: F601620-9001)
- 1 ml RNase-free枪头 (KIRGEN,catalog number: KG1333)
- RiboLock RNase Inhibitor (Thermo ScientificTM, catalog number: EO0382)
- cOmpleteTM, Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche, catalog number: 04693124001)
- Phosphatase Inhibitor Cocktail (ApexBio, catalog number: K1014)
- PierceTM Protein A/G Plus Agarose (Thermo ScientificTM, catalog number: 20423)
- Primary antibody (根据实验需求,选择)
- TRIzolTM Reagent (InvitrogenTM, catalog number: 15596018)
- Superase.IN (InvitrogenTM, catalog number: AM2694)
- GlycoBlue (InvitrogenTM, catalog number: AM9516)
- Proteinase K (InvitrogenTM, catalog number: 25530015)
- 水饱和酚 (InvitrogenTM, catalog number: AM9710)
- 氯仿 (国药, catalog number: 10006818)
- 无水乙醇 (国药, catalog number: 10009218)
- 异戊醇 (国药, catalog number: 10003218)
- IgG (CST, 根据一抗来源)
- Tris (生工,catalog number: A501492-0005)
- NaCl (生工,catalog number: A501218-0001)
- MgCl2 (国药,catalog number: 10012818)
- NP-40 (生工,catalog number: A100109-0100)
- SDS (麦克林,catalog number: 151-21-3)
- Sodium deoxycholate (sigma,catalog number: 30970-25G)
- Na2HPO4·12H2O (国药,catalog number: 10020318)
- KH2PO4 (生工,catalog number: A100781-0500)
- 醋酸钠 (生工,catalog number: A110530-0500)
- DEPC (Sigma,catalog number: D5758-25ML)
- 1x RIPA裂解液 (见溶液配方)
- Proteinase K buffer (见溶液配方)
- NT2 buffer (见溶液配方)
- 10x PBS (见溶液配方)
仪器设备
- 15 cm 细胞培养皿 (Excell,catalog number: CS016-0129)
- 细胞刮刀 (阿拉丁,catalog number: C6587-01-10A)
- -80 °C冰箱
- 小型低温离心机
- Thermomixer
- 移液器
- 旋转仪
- Vortex
实验步骤
一、准备样品
- 取一盘15 cm培养皿培养的MDA-MB-231细胞 (细胞密度约80%-90%),用移液器吸去培养液,放置于冰上,加入5 ml冰冷的1x PBS,轻轻晃动,用移液枪吸去1x PBS。
- 加入2 ml冰冷的1x PBS,用细胞刮刀将细胞刮下来,并转移到2 ml离心管中。在4 °C 2,500 rpm的条件下离心5 min,用移液枪吸出上清。
- (可选择) 将细胞在液氮中短暂冷冻后,保存于-80 °C冰箱中。
二、裂解细胞
- 往细胞中加入1.5 ml 1x RIPA裂解液 (加入50 U/ml RiboLock RNase Inhibitor、50 U/ml Superase.IN、1x Protease Inhibitor Cocktail和1x Phosphatase Inhibitor Cocktail),轻轻吹打重悬细胞,冰上孵育20 min,在4 °C 12,000 rpm的条件下离心15 min,取上清于新的2 ml离心管中。
- 取10 µl蛋白裂解液标记“Input”,存放在-80 °C冰箱中直到进行第四步实验时取出,与IP样品同步进行RNA纯化实验。
- (可选) 取10 µl的蛋白裂解液用于Western blot。
三、免疫沉淀
- 将剩余蛋白裂解液均分成两份,每份740 µl。一份加入适量蛋白抗体,另一份加入等量的IgG作为阴性对照,在4 °C旋转孵育4 h。
- 取60 µl Protein A/G PLUS-Agarose beads,1 ml NT2 buffer旋转洗涤10 min,在4 °C 3,000 rpm的条件下离心5 min,重复洗涤3次。
- 将beads均分成两份,每份500 µl,去掉上层的NT2 buffer,分别将与抗体孵育的细胞裂解液加入到beads中,在4°C旋转孵育过夜。
- 洗涤beads。
四、蛋白酶K消化
- 准备proteinase K buffer
每个样品中加入150 µl proteinase K buffer:117 µl NT2 buffer,15 µl 10% SDS,18 µl 10 mg/ml proteinase K。 - 将步骤三中的beads,在4 °C 3,000 rpm的条件下,离心5 min,吸去上清液,每个样品中加入150 µl proteinase K buffer重悬beads,将样品放在Thermomixer中1,000 rpm,55 °C反应30 min,消化蛋白。
- 将样品放入4 °C离心机中,在3,000 rpm条件下,离心5 min,上清液转移到新的1.5 ml离心管中,加入250 µl NT2 buffer,至样品总体积为400 µl。
五、酚氯仿抽提RNA
- 加入400 µl苯酚:氯仿:异戊醇 (125:24:1) 混合液,vortex震荡15 s,14,000 rpm室温离心10 min。
- 上层水相 (约350 µl) 转移到新的1.5 ml离心管中,加入等体积的氯仿,vortex震荡15 s,14,000 rpm室温离心10 min。
- 上层水相 (约300 µl) 转移到新的1.5 ml离心管中,加入0.5 µl GlycoBlue,混匀;加入1/10体积的醋酸钠,混匀;再加入2.5倍体积的无水乙醇,混匀,-80 °C冰箱中沉淀1 h或者-20 °C冰箱中沉淀过夜。
- 在4°C 14,000 rpm条件下离心30 min,弃掉上清。
- 用80%的乙醇洗涤RNA沉淀,在4 °C 14,000 rpm条件下离心15 min,弃掉上清,室温放置待乙醇完全挥发。
- 加入20 µl DEPC水溶解RNA,存放在-80 °C冰箱中,或者进行反转录实验、RT-qPCR检测。
溶液配方
- NT2 buffer
50 mM Tris-HCl pH7.5
150 mM NaCl
1 mM MgCl2
0.05% NP-40 - 1x RIPA Buffer
0.5% sodium deoxycholate
50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
150 mM NaCl
1% NP-40
0.1% SDS - 10x PBS buffer
NaCl 40 g
KCl 1 g
Na2HPO4·12H2O 17.9 g
KH2PO4 1.35 g
水定容至500 ml
注:本实验中所有试剂均为用DEPC处理水配制,用到的仪器均用RNaseZap湿巾擦拭;实验操作过程中,戴一次性口罩、帽子、手套,避免RNase污染。
致谢
我们感谢中国自然科学基金 (81672791, 81872300) 和浙江省杰出青年自然科学基金(LR18C060002) 对我们实验工作的支持,同时也感谢实验室各位成员之间在科研工作中的密切协作和配合,使得我们的实验能够顺利,稳定进行。
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