利用RNA免疫共沉淀以及RT-qPCR实验验证MDA-MB-231-LM2细胞中LDHA蛋白与非编码RNA LINC00973的相互作用
Detecting the Interaction between non-coding RNA LINC00973 and LDHA Protein in MDA-MB-231-LM2 Cells by RNA Immunoprecipitation and RT-qPCR   

研究背景

随着对蛋白质功能研究的深入，越来越多的蛋白质被发现具有RNA结合能力。RIP实验可帮助我们快速确定靶蛋白能否结合我们感兴趣的目的RNA。通过靶蛋白的特异性抗体，我们可以将结合在靶蛋白上的RNA与靶蛋白和抗体一同沉淀下来。之后收集沉淀物，再消化去除蛋白质，便可得到靶蛋白结合的RNA。随后我们通过RT-qPCR实验分析我们感兴趣的目的RNA是否在总RNA里富集，便能确定我们感兴趣的目的RNA是否特异性结合靶蛋白。相比于其他基于蛋白去鉴定互作RNA的技术，如CLIP-seq等，RIP实验具有实验流程短、操作简便易上手、花费少等优点，是我们研究蛋白质与RNA互作常用的技术。本文结合我们实验室已发表的文章，通过利用RIP技术验证在乳腺癌细胞系MDA-MB-231-LM2中LDHA蛋白与非编码RNA LINC00973的相互作用这一例子，具体阐述RIP实验的操作流程与分析方法(Wang et al., 2021)。

材料与试剂

1. 100 mm细胞培养皿
2. 胰酶 (Thermo Fisher, catalog number: 25200072)
3. 冰盒
4. Protein A + G磁珠 (Millipore, catalog number: 16-663)
5. LDHA抗体 (Proteintech, catalog number: 21799-1-AP)
6. IgG抗体 (CST, catalog number: 2729S)
7. RNasin ribonuclease inhibitor (Promega, catalog number: N2511)
8. 蛋白酶K (Roche, catalog number: 3115879001)
9. Tris-HCl (pH = 7.5, Invitrogen, catalog number: 15567027)
10. NaCl (国药，catalog number: 10019318)
11. SDS (Macklin, catalog number: S817788-500G)
12. NP-40 (Macklin, catalog number: N885725-100 mL)
13. EDTA (Amresco, catalog number: 0322-1KG)
14. PMSF (碧云天，catalog number: ST506)
15. DTT (Amresco, catalog number: 0281)
16. Protease inhibitor cocktail (Amresco, catalog number: M221-1ML)
17. UltraPure^TM DNase/RNase-Free Distilled Water (Invitrogen, catalog number: 10977023)
18. 1x PBS缓冲液 (Hyclone, catalog number: SH30256.01)
19. TRIzol (Invitrogen, catalog number: 15596018)
20. 氯仿 (国药, catalog number: 67-66-3)
21. 异丙醇 (国药, catalog number: 67-63-0)
22. 无水乙醇 (国药, catalog number: 64-17-5)
23. 5x RIP缓冲液 (见溶液配方)
24. 细胞裂解缓冲液 (见溶液配方)
25. 蛋白酶K缓冲液 (pH = 7.5) (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液器
2. 移液器枪头 (DNase free, RNase free)
3. 1.5 ml EP管 (DNase free, RNase free)
4. 磁力架
5. 4 °C冰箱
6.  -80 °C冰箱
7. 恒温金属震荡仪
8. 4 °C离心机
9. 旋转混匀仪 (EASYBIO, catalog number: BE-1100)
10. 荧光定量PCR仪（LightCycler96，Roche）
    

实验步骤

一、样品制备

1. 将MDA-MB-231-LM2培养在 100 mm细胞培养皿中。待细胞铺满约90%培养皿底部时，移除培养基，用PBS洗涤细胞两次，再用5%胰酶消化细胞，用培养基重悬，进行细胞计数。
2. 收集2×10⁷个细胞，在100 × g转速条件下离心5 min去除培养基，再用PBS洗涤细胞沉淀两次。最后一次洗涤时，离心去除上清。向EP管中的细胞沉淀加入300 μl细胞裂解缓冲液，吹打混匀后放置于旋转混匀仪上，于4 °C，10 rpm条件下裂解30 min。将裂解后的样品放至4 °C预冷的离心机中 13,000 × g离心15 min，收取上清，放置于-80 °C中保存备用，或直接进行下一步的免疫沉淀实验。
   
   
   

二、RNA结合蛋白免疫共沉淀

1. 取30 μl Protein A+G磁珠，用1 ml 1x RIP (25 mM Tris-HCl (pH = 7.5)，100 mM NaCl，0.5% NP-40，1 mM PMSF，1×Protease inhibitor cocktail，25 U/ml RNasin ribonuclease inhibitor) 缓冲液洗涤两次，然后用150 µl 1× RIP缓冲液重悬，加入5 µg LDHA一抗 (设置一个阴性对照组加入5 µg IgG)，置于旋转混匀仪上4 °C混匀2 h，使得抗体充分结合到磁珠上。待反应完成之后，再用1 ml 1× RIP缓冲液轻轻洗涤磁珠两次。
2. 从离心后的细胞裂解液(约300 µl) 中吸取100 µl加入偶联了靶蛋白抗体的磁珠中，再吸取100 µl加入偶联了IgG的磁珠中，在4 °C下孵育8 h或者过夜孵育。余下的细胞裂解液取50 µl用于RNA Input，取30 µl用于蛋白Input，置于-20 °C冻存备用。
3. 完成孵育反应后，用 1 ml 5× RIP缓冲液 （额外加入RNA酶抑制剂和蛋白酶抑制剂：1 mM PMSF，1×Protease inhibitor cocktail，25 U/ml RNasin ribonuclease inhibitor）洗涤磁珠5次，洗涤时每次在旋转混匀仪上充分混匀5 min，然后置于磁力架上吸附去除上清。在最后一次洗涤时，改用300 µl 1× RIP缓冲液进行重悬，取30 µl用于Western Blot验证抗体的IP效率。
4. 将其余的重悬液通过磁力架去除洗涤缓冲液之后，加入190 µl蛋白酶K缓冲液重悬，然后加入10 µl蛋白酶K (储液浓度为2 mg/ml)混匀。另外，将之前保存备用的RNA input取10 µl也加入180 µl蛋白酶K缓冲液和10 µl蛋白酶K。将实验组、阴性对照组与RNA input组样品一起置于恒温金属震荡仪上，在56 °C、800 rpm条件下加热震荡1 h消化蛋白质。

三、TRIzol法提取RNA (Rio et al., 2010)

1. 完成蛋白消化后，每个样品中加入600 µl TRIzol，混匀；再加入120 µl氯仿充分混匀，静置5 min，等待分层。
2. 出现分层后，放入预冷的4 °C离心机进行离心，13,000 × g 离心15 min，取上层液体，小心不要碰触到中间分层。
3. 加入1/2上清液体积的异丙醇，混匀静置5 min，然后置于预冷的离心机中4 °C，13,000 × g离心15 min。
4. 离心完成后小心移除上清，加入500 μl 75%乙醇对RNA沉淀物进行洗涤，轻轻震荡使底部沉淀重悬起来，4 °C，13,000 × g离心5 min，去除上清完成一次洗涤。
5. 重复一次75%乙醇洗涤。
6. 打开EP管盖，室温静置15 min使管底残留的乙醇溶液充分挥发，加入20 μl DEPC水溶解RNA沉淀物。待核酸充分溶解后测浓度，置于-80 °C冰箱保存。

四、Western blot实验及RT-qPCR实验分析

1. Western blot实验：各取15 μl的实验组重悬液、阴性对照组重悬液及 5 μl蛋白input做western blot实验。采用靶蛋白LDHA一抗来检测各组样品中LDHA蛋白含量差异，以验证LDHA一抗能够特异性地与LDHA结合。
2. RT-qPCR实验：取实验组的RNA、阴性对照组的RNA和input RNA各3 μl 做RT-qPCR实验。采用目的RNA LINC00973、阴性对照的18S rRNA和7SK RNA的RT-qPCR引物检测各组样品中LINC00973、18S rRNA、7SK RNA的含量。通过分析各组样品中RNA的回收效率差异，以验证LDHA蛋白能够特异性地结合RNA LINC00973。

实验数据示例与分析

一、Western blot实验结果分析
我们针对本次实验做了三次重复，并将三次重复结果的实验组重悬液 (用anti-LDHA)、阴性对照组重悬液 (用anti-IgG)及蛋白input一起进行Western blot实验，检测各组样品中LDHA蛋白含量差异。结果如Figure 1所示，input组能与LDHA抗体杂交出有较亮的条带，说明在MDA-MB-231-LM2细胞中正常表达LDHA蛋白。同样，3个实验组中均能显示出较亮的条带，但是3个阴性对照组却没有条带出现，这说明IgG一抗不能结合LDHA蛋白，而LDHA一抗能够结合LDHA蛋白并且这种结合是具有特异性的。


Figure 1. Western blot实验验证LDHA一抗能够与LDHA蛋白特异性结合(Wang et al., 2021).

二、RT-qPCR实验结果分析
我们针对本次实验做了三次重复，并对3次结果进行了分析。RNA的回收效率是指通过我们用蛋白一抗结合靶蛋白，间接结合的目的RNA的总量，占原细胞中该目的RNA总量的百分比。RT-qPCR实验的直接结果是Ct值，还要进一步公式换算。以实验组为例，换算公式是
回收效率=2^{(Ct（input）-Ct(实验组RNA))}÷稀释倍数×100%
在本实验中，我们取10 μl RNA input，即细胞裂解液，做蛋白质消化和RNA提取操作；取100 μl 细胞裂解液作为实验组，之后用300 µl 1× RIP缓冲液重悬，取走30 μl 作为western blot实验样品，剩余(300-30=270) μl。所以稀释倍数=100×270÷300÷10=9
结果如图Figure 2所示，实验组的LINC00973回收效率显著高于阴性对照组，说明实验组里的LDHA蛋白能够结合RNA LINC00973，导致LINC00973显著富集。18S和7SK的低回收效率说明LDHA结合RNA的能力是有选择性的。所以实验结果证明了LDHA蛋白能够特异性结合RNA LINC00973。


Figure 2. LDHA与LINC00973特异性结合(Wang et al., 2021).

注意事项

1. 所有的实验用品都要保证没有RNase和蛋白酶，以免RNA和蛋白质的降解干扰实验结果。实验操作前最好用RNase喷雾清除剂擦拭手套、实验台、移液器、冰盒等用到的实验器材，以清除实验环境中的外源RNase。RIP缓冲液和细胞裂解缓冲液的配置，要额外添加RNase抑制剂和蛋白酶抑制剂，避免细胞内的RNase和蛋白酶破坏RNA和蛋白质。另外，本实验里用到的所有的溶液，都要用DEPC水来配置，以避免水中带有外源RNase对实验的干扰。
2. 本实验大部分操作需要在冰上进行，以减少RNA的降解。
3. 要确保所用抗体的结合能力以及特异性，这是RIP实验成功的前提。
   

溶液配方

1. 5 × RIP缓冲液
   125 mM Tris-HCl (pH = 7.5)
   500 mM NaCl
   2.5% NP-40
2. 细胞裂解缓冲液
   RIP缓冲液 (1×)（将5 × RIP缓冲液稀释5倍获得）
   1 mM DTT
   1 mM PMSF
   1x Protease inhibitor cocktail
   25 U/ml RNasin ribonuclease inhibitor
3. 蛋白酶K缓冲液 (pH = 7.5)
   100 mM Tris-HCl
   100 mM NaCl
   0.5% SDS
   1 mM EDTA
4. 75%乙醇 (10 ml)
   7.5 ml 无水乙醇
   2.5 ml DEPC水
   

参考文献

1. Gilbert, C. and Svejstrup, J. Q. (2006). RNA immunoprecipitation for determining RNA-protein associations in vivo. Curr Protoc Mol Biol Chapter 27: Unit 27 24.
2. Gagliardi, M. and Matarazzo, M. R. (2016). RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods Mol Biol 1480: 73-86.
3. Rio, D. C., Ares, M., Jr., Hannon, G. J. and Nilsen, T. W. (2010). Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc 2010(6): pdb.prot5439.
4. Wang, H., Lin, K., Zhu, L., Zhang, S. and Wang, D. (2021). Oncogenic lncRNA LINC00973 promotes warburg effect by enhancing LDHA enzyme activity. Science Bulletin 66(4).

Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.

引用格式：朱林, 王会丽, 王栋. (2022). 利用RNA免疫共沉淀以及RT-qPCR实验验证MDA-MB-231-LM2细胞中LDHA蛋白与非编码RNA LINC00973的相互作用. Bio-101: e1010809. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010809.
How to cite: Zhu, L., Wang, H. L. and Wang, D. (2022). Detecting the Interaction between non-coding RNA LINC00973 and LDHA Protein in MDA-MB-231-LM2 Cells by RNA Immunoprecipitation and RT-qPCR. Bio-101: e1010809. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010809.