秀丽隐杆线虫小RNA提取与多磷酸修饰处理
Extracting and Sequencing of Small Interfering RNAs in Caenorhabditis elegans   

研究背景

在秀丽隐杆线虫的RNA干扰过程中，外源的双链RNA（dsRNA）被注射或喂食到线虫体内后，被DICER切割成短的dsRNA，再由RDE-1结合，进而诱导靶标mRNA的降解沉默。之后在RdRP（RNA dependent RNA Polymerase，RNA依赖的RNA聚合酶）的作用下，诱导次级siRNA，即22 GRNA生成，并被WAGO蛋白结合。另外，线虫体内还存在有内源性的初级siRNA，这类小RNA长为26nt，5’末端为G且有单磷酸修饰，被称为26G RNA。26G RNA也可以作为沉默的初级信号，诱导次级小RNA，22G RNA的生成(Billi et al., 2014)。22G RNA长为22 nt，5’末端为G且具有三磷酸修饰，使得该RNA并不能直接建库测序。对这一类22G RNA进行测序时，需要将RNA的5’末端的三磷酸处理为单磷酸结构，进而进行建库测序(Ruby et al., 2006; Gu et al., 2012)。其中CIAP可以将RNA 5’末端的磷酸基团去除，转为羟基，而T4 PNK可以将5’末端羟基加上单磷酸修饰。使用CIAP和T4 PNK处理，可以对三磷酸修饰的小RNA后续的建库和测序。

材料与试剂

一、一次性耗材

1. Billi, A. C., Fischer, S. E. and Kim, J. K. (2014). Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook: 1-49. 1.RNase free离心管 50 ml Corning, catalog number:430828），15 ml（Corning, catalog number:430791），1.5 ml（Nest, catalog number:615001）
2. 普通离心管 15 ml，50 ml
3. RNase free枪头 1,000 μl，200 μl，20 μl，10 μl
4. 一次性口罩Axygen, catalog number: TF-1000-R-S, TF-200-R-S, TF-20-R-S, TF-10-R-S）
5. 一次性培养皿 直径90 mm，60 mm，35 mm（培养线虫用）
6. 超声破碎管（Invitrogen，catalog number: Q3285）

1. 秀丽隐杆线虫（实验室培养）
2. 大肠杆菌OP50（实验室培养）

1. MgSO₄（Sangon Biotech, catalog number: A601988）
2. NaCl（Sangon Biotech, catalog number: A610476）
3. Na₂HPO₄（Sangon Biotech, catalog number: A501727）
4. KH₂PO₄（Sangon Biotech, catalog number: A100781）
5. NP-40（Sangon Biotech, catalog number: A800385）
6. Tris（Sangon Biotech, catalog number: A600194）
7. NaOH（Sangon Biotech, catalog number: A100583）
8. NaClO（国药, catalog number:7681-52-9）
9. MgCl₂（Sangon Biotech，catalog number: A100288）
10. DEPC-treated water（Sangon Biotech, catalog number: B50100，预冷）
11. TRIzol（Life technologies, catalog number: 15596026，预冷）
12. Chloroform，氯仿（索莱宝，catalog number: P1014预冷）
13. 75%乙醇（100%乙醇:DEPC-treated water 3:1，预冷）
14. Isopropanol，异丙醇（Sangon Biotech, catalog number: A507048，预冷）
15. RNase inhibitor (Thermo fisher，catalog number: EF0651，storage at -20 °C)
16. DNase I (Thermo fisher, catalog number: 18047019, storage at -20 °C)
17. RNA 5′ Polyphosphatase (Lucigen, catalog number: RP8092H, storage at -20 °C) 
18. CIAP (Invitrogen, catalog number: 18009019, storage at -20 °C)
19. T4 PNK（Thermo ScientificTM EK0031, storage at -20 °C）
20. Glycerol（Sangon Biotech, catalog number: A600232）
21. 10x M9（见溶液配方）
22. 2x bleach液（见溶液配方）
23. Sonication buffer（见溶液配方）

仪器设备

一、实验器皿

1. 玻璃瓶 1,000 ml，500 ml，250 ml，100 ml
2. 塑料量筒 500 ml，200 ml，100 ml
3. 玻璃移液管 15 ml，25 ml

1. 摇床（海门其林贝尔, TS-8）
2. 冷冻离心机（Eppendorf, 5415R）
3. 普通离心机（Eppendorf, Centrifuge 5702）
4. 37 °C烘箱（上海智诚，ZDP-2120）
5. 冰箱（20 °C，4 °C，-20 °C，-80 °C）
6. Vortex（IKA，Vortex2）
7. 超声破碎仪（Diagenode，Bioruptor UCD-200）
8. 体式显微镜（MOTIC，SMZ168）
9. 电子秤（梅特勒，AL104）
10. 高温高压灭菌锅（致微，G154DWS）
11. 电子移液枪（Eppendorf）
12. 移液枪（Brand, 1,000 μl，200 μl，20 μl，2 μl）
13. 真空泵（海门其林贝尔，GL802B）

实验步骤

实验步骤流程如图2所示。


图2. 实验步骤流程示意图

一、收取线虫样品（以Late Young Adult时期线虫为例）

1. 使用90 mm培养皿固体培养线虫（一支样品约需2个培养皿的线虫，约4,000到6,000条，由此提供下一代线虫），待培养皿上线虫数量足够多且大部分到达成虫时期（注：提供足够的细菌食物，别让培养皿上线虫进入饥饿状态），进行线虫同步化。
2. 线虫同步化操作：
   1. 用电子移液枪和玻璃移液管吸取10 ml 1x M9将培养皿上的线虫转移到15 ml离心管中。
   2. 转移完成后，将离心管离心（2,500 rpm，0.5 min），保留管中5 ml液体，弃多余液体。再加入5 ml 2x bleach液，在摇床上快速震荡约5 min（可提前在体式显微镜下观察，大部分虫体破碎即可），离心（2,500 rpm，0.5 min），弃上清。
   3. 加入5 ml 1x M9清洗，涡旋混匀，离心（2,500 rpm，0.5 min），弃上清，重复此步骤3次。用枪头适度轻柔吹打，将沉淀的虫卵重悬之后，逐滴转移到90 mm培养板上，培养板放置于20 °C恒温培养箱中培养，约2.5-3.5天后发育到年轻成虫后期（注：不同基因型或者突变背景的线虫品系，到达年轻成虫后期的时间有所不同，以大部分线虫即将产卵或刚开始产卵的时间为准。另外，每个板上转移配置的虫卵要适量，防止线虫培养过程中进入饥饿状态）。
3. 收集并清洗线虫。将同步化后Late Young Adult时期的线虫冲洗到15 ml离心管中，离心（2,500 rpm，0.5 min），弃上清（用真空泵吸出，注意不要将虫子吸出）。加入10 ml 1x M9，放在摇床上缓慢摇动约10 min，离心（2,500 rpm，0.5 min），弃上清，再加入10 ml 1x M9离心（2,500 rpm，0.5 min），弃上清。将线虫转移至1.5 ml RNase free离心管，每管约40 μl虫体（约1000-2000条成虫）。一管虫体作为一份样品。样品需冻存在-80 °C冰箱中。

二、核酸提取（注：后续实验时带好口罩，防止吸入有毒试剂及RNA被污染，实验均用RNase free枪头，所用离心管均为RNase free离心管，所有离心均在冷冻离心机中，加试剂间隙尽量将样品放在冰上，建议将所用的1.5 ml 离心管预冷。）

4. 取出-80 °C冰箱中的样品，加入1 ml sonication buffer，待样品融化后，使用冷冻离心机离心（1,000 rpm, 1 min），弃上清，留下沉淀及液体约40 μl。
5. 用移液枪打匀并吸取30 μl虫体到500 μl超声破碎管中，加入70 μl sonication buffer，加入RNase inhibitor（4 μl/1,000 μl sonication buffer）。
6. 用超声破碎仪（Biorupter UCD200，15S ON, 45S OFF，Middle level）循环6次进行虫体破碎，每两个循环取出样品离心一次，1,000 rpm，1 min。
7. 将100 μl液体转移到1.5 ml 离心管中。
8. 加入400 μl TRIzol（预冷，TRIzol为易挥发有毒试剂，谨防吸入），涡旋混匀10 s，快速离心10 s。
9. 加入100 μl 氯仿（预冷，氯仿为易挥发有毒试剂，谨防吸入），涡旋混匀10 s，冰上静置至少1 min。
10. 用冷冻离心机离心静置后的样品，12,000 rpm 15 min。吸取上清到新的1.5 ml 离心管中（可以观察到液体分层，上清透明，下层为粉红色，中层有破碎后的虫体等杂质，只吸取透明上清部分，建议将移液枪调到300 μl吸取）。
11. 加入300 μl 异丙醇（与离心管中的液体体积对等，预冷），轻微来回颠倒离心管，充分混合液体，放在冰上或4 °C冰箱中静置，1 h以上（注：可以放在4 °C或 -20 °C冰箱中过夜静置）。
12. 冷冻离心机离心静置后的样品，12,000 rpm 15 min。（可以观察到离心管底部有白色沉淀，此为核酸）
13. 用真空泵吸尽上清（注：也可用移液枪将上清吸尽），加入400 μl 75%乙醇（预冷），12,000 rpm离心3 min。洗两次。弃尽上清。
14. 将离心管开盖，让未吸尽的液体蒸发（3-5 min），加入20 μl DEPC-treated water（预冷）溶解核酸。

三、用DNase I消化（将核酸中的DNA降解，保留RNA）

15. 在核酸溶液中加入DNase I消化体系，静置于37 °C烘箱中，30 min。反应体系如下：
    10x DNase I buffer    5 μl
    DNase I                       2 μl
    RNA inhibitor             1 μl
    DEPC-treated water22 μl
16. 重复步骤8-14。（注：即从加入TRIzol，氯仿至DEPC-treated water溶解核酸的所有步骤）

四、用CIAP酶处理 [将5′三磷酸（5′ ppp-NN）或5′单磷酸（5′ p-NN）RNA处理成5′端羟基（5′ OH-NN）]

17. 在核酸溶液中加入CIAP酶或者FastAP酶消化体系，静置于37 °C烘箱中，30 min。反应体系如下：
    10x CIAP buffer           5μl
    CIAP酶                          2μl
    RNA inhibitor              1μl
    DEPC-treated water22μl
18. 重复步骤8-14。（注：即从加入TRIzol，氯仿至DEPC-treated water溶解核酸的所有步骤）
    
    
    

五、用T4 PNK酶修饰 [将5′端羟基（5′ OH-NN）RNA转化为5′ 单磷酸（5′ p-NN）RNA]

19. 在核酸溶液中加入T4 PNK酶反应体系，静置于37 °C烘箱中，60 min。反应体系如下：
    10x T4 PNK buffer A5 μl
    T4 PNK酶                   2 μl
    RNA inhibitor            1 μl
    ATP                             1 μl
    DEPC-treated water21 μl

20. 重复步骤8-14。（注：即从加入TRIzol，氯仿至DEPC-treated water溶解核酸的所有步骤）
    

六、Small RNA-seq（注：如需检测带有5′三磷酸的小RNA，做完第20步后测序；如只检测5′单磷酸的小RNA，跳过17-20步）

21. 将RNA溶液送测序公司，每个RNA样品3μg即可，选择RNA条带大小为18~ 40nt，使用NEBNext ®Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina试剂盒进行建库，将建库得到的DNA使用安捷伦生物分析仪2100进行分析后，进行单端深度测序。

溶液配方

1. 10x M9
   

   	Total 1,000 ml
   NaCl	50 g
   Na2HPO4	60 g
   KH2PO4	30 g
   ddH20	990 ml

    上述试剂配置完，使用灭菌锅进行120 °C 高压灭菌20分钟，待溶液冷却后，再加入10 ml 1 M MgSO₄。
   注：用ddH₂O稀释10x M9 10倍，配置成1x M9使用。
   
   
2. 2x bleach液
   

   	Totol 200 ml
   10 M NaOH	20 ml
   NaClO溶液（活性氯 >= 5.2%）	80 ml
   ddH2O	ml

   
   
3. Sonication buffer
   

   	stock	Total 500 ml
   0.5% NP-40		2.5 ml
   20 mM Tris pH 7.5	1 M	10 ml
   200 mM NaCl	5 M	20 ml
   2.5 mM MgCl2	1 M	1.25 ml
   10% glycerol		50 ml
   DEPC-treat water		补齐至500 ml

    注：10% glycerol 可稍微加热后量取，sonication buffer存放于RNase free处理的玻璃试剂瓶中，存放于4 °C。
   

致谢

该文章得到了国家重大科学研究计划(批准号: 2018YFC1004500和2017YFA0102900)、国家自然科学基金(批准号: 31671346，91940303，31870812，31871300，31900434)的支持。该实验方案改编自光寿红教授课题组的实验操作手册，在此向该实验室的老师和同学们表示感谢；使用该实验方案发表的文章(Zhou et al., 2017; Zhu et al., 2018)

参考文献

1. Billi, A. C., Fischer, S. E. and Kim, J. K. (2014). Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook: 1-49.
2. Gu, W., Lee, H. C., Chaves, D., Youngman, E. M., Pazour, G. J., Conte, D., Jr. and Mello, C. C. (2012). CapSeq and CIP-TAP identify Pol II start sites and reveal capped small RNAs as C. elegans piRNA precursors. Cell 151(7): 1488-1500.
3. Ruby, J. G., Jan, C., Player, C., Axtell, M. J., Lee, W., Nusbaum, C., Ge, H. and Bartel, D. P. (2006). Large-scale sequencing reveals 21U-RNAs and additional microRNAs and endogenous siRNAs in C. elegans.Cell 127(6): 1193-1207.
4. Zhou, X., Feng, X., Mao, H., Li, M., Xu, F., Hu, K. and Guang, S. (2017). RdRP-synthesized antisense ribosomal siRNAs silence pre-rRNA via the nuclear RNAi pathway. Nat Struct Mol Biol 24(3): 258-269.
5. Zhu, C., Yan, Q., Weng, C., Hou, X., Mao, H., Liu, D., Feng, X. and Guang, S. (2018). Erroneous ribosomal RNAs promote the generation of antisense ribosomal siRNA. Proc Natl Acad Sci U S A 115(40): 10082-10087.