摘要::在254 nm紫外线照射下,RBP (RNA Binding Protein,RBP) 与其结合的RNA能够发生共价交联,通过免疫共沉淀技术富集目的蛋白及其RNA靶标,并结合强大的高通量测序技术,我们能够精确地鉴定全转录组范围内目的蛋白的RNA结合图谱。因此,CLIP-seq (CrossLinking and ImmunoPrecipitation coupled with high-throughput sequencing,CLIP-seq) 是全面鉴定RNA结合蛋白靶标,解析其生物学功能的强有力技术手段。本方案以RNA解旋酶DDX17为例,探究其在人HeLa细胞系中的RNA结合图谱。
关键词: RBP, 高通量测序, CLIP-seq, DDX17
材料与试剂
- 15 cm培养皿
- 15 ml离心管
- 移液器枪头
- DNA/RNA lobind tube 1.5 ml (Eppendorf, catalog number: 022431021)
- DNA/RNA lobind tube 2.0 ml (Eppendorf, catalog number: 022431048)
- HeLa细胞
- RQI RNase-free DNase (Promega, catalog number: M6101)
- DDX17 antibody (Proteintech, catalog number: 19910-1-AP)
- Normal Rabbit IgG (CST, catalog number: 2729)
- RNAsin (Promega, catalog number: N2611)
- Micrococcal Nuclease (Thermo Scientific, catalog number: EN0181)
- Dynabeads Protein G (Life Technologies, catalog number: 10004D)
- FastAP (Life Technologies, catalog number: EF0652)
- T4 RNA ligase 2 tr KQ (NEB, catalog number: M0351)
- T4 PNK (NEB, catalog number: M0201L)
- T4 RNA ligase 1 high concentration (NEB, catalog number: M0437M)
- ATP (Invitrogen, catalog number: 18330019)
- 32P-γ-ATP (PerkinElmer, catalog number: NEG502A250UC)
- NuPAGE 4%~12% Bis-Tris Gel (Invitrogen, catalog number: NP0321BOX)
- NuPAGE LDS Sample Buffer (Invitrogen, catalog number: NP0007)
- NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20×) (Invitrogen, catalog number: NP0001)
- NuPAGE Transfer Buffer (20×) (Invitrogen, catalog number: NP0006)
- Proteinase K (Thermo Scientific, catalog number: EO0491)
- Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 (Thermo Scientific, catalog number: R1181)
- GlycoBlue Coprecipitant (Invitrogen, catalog number: AM9515)
- SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, catalog number: 18080044)
- Exo-SAP-IT (Affymetrix, catalog number: 78201)
- Dynabeads MyOne Silane (Life Technologies, catalog number: 37002D)
- RLT buffer (Qiagen, catalog number: 79216)
- Phusion High-Fidelity DNA polymerase (Thermo Scientific, catalog number: F530S)
- QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, catalog number: 20021)
- Oligos (Takara)
3’ APP-DNA linker:
rAppp-TGTAGGCACCATCAAT-NH2
5’ DNA linker:
5Phos/NNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGT/3spc3
RT primer:
TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG
short xrn1 F primer:
ACACGACGCTCTTCCGATCT
short xrn1 R primer:
TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
long xrn1 F primer:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
A701R primer:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
A702R primer:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT - SDS (Biosharp, catalog number: BS088)
- NP-40 (Amresco, catalog number: M158)
- 1M Tris-HCl (pH 7.5) (Invitrogen, catalog number: 15567-027)
- MgCl2·6H2O (上海国药, catalog number: 10012818)
- EGTA (Millipore, catalog number: 324626)
- NaOH (上海国药, catalog number: 10019718)
- NaCl (上海国药, catalog number: 10019318)
- Na2EDTA (Sigma, catalog number: E5134)
- MOPS (Sigma, catalog number: M1254)
- Tris (Amresco, catalog number: 0497)
- Bicine (Sigma, catalog number: B3876)
- Bis-Tris (Sigma, catalog number: B9754)
- 甲醇 (上海国药, catalog number: 10014118)
- PEG 8000 (US Pharmacopeia, catalog number: 1546605)
- 3M醋酸钠 (pH 5.5) (Ambion, catalog number: AM9740)
- Glycoblue (Ambion, catalog number: AM9515)
- 无水乙醇 (上海国药, catalog number: 10009218)
- 异丙醇 (上海国药, catalog number: 80109218)
- 氯仿 (上海国药, catalog number: 10006818)
- 水饱和酚 (Ambion, catalog number: AM9720)
- Washing buffer (见溶液配方)
- PNK buffer (见溶液配方)
- PNK + EGTA buffer (见溶液配方)
- MN buffer (见溶液配方)
- PK buffer (见溶液配方)
- 20× MOPS buffer (见溶液配方)
- 20× Transfer buffer (见溶液配方)
- 1× Transfer buffer (见溶液配方)
仪器设备
- 移液器
- -80 °C冰箱
- 普通PCR仪 (Bio-Rad)
- 普通离心机及冷冻离心机 (Eppendorf)
- 热混仪 (Eppendorf)
- 紫外交联仪 (UVP HL-2000 Hybrilinker)
- 紫外凝胶成像系统 (Gene Genius)
- 电泳仪、转膜槽 (北京六一公司)
- 跑胶槽XCell SureLock Mini-Cell (Invitrogen)
- 超净工作台 (哈东联公司)
- 生物安全柜 (Heal Force)
- 细胞培养箱(Thermo scientific)
- pH计 (梅特勒-托利delta-320)
- 超低温冰箱 (三洋)
- 暗盒、X胶片 (富士)
- 自动洗片机 (江苏泰星)
- 盖革计数器 (model3美国Iudlum公司)
实验步骤
一、UV交联细胞
- 首先将HeLa细胞传代至15 cm培养皿中,待细胞生长至80%-90%丰度时开始处理细胞。
- 吸弃旧的DMEM培养基,用10 ml预冷的1× PBS漂洗细胞,再加入10 ml预冷的1× PBS,放置合适大小的冰袋于紫外交联仪中,将细胞培养皿平置于冰袋上,选择254 nm紫外灯管 (UV-C),设置交联能量为400 mJ/cm2。
- 交联完成后,用细胞刮刀将细胞刮下,收集到15 ml离心管中,4 °C,100 g离心5 min。
- 弃上清,加入1 ml预冷的1× PBS重悬细胞并转移至1.5 ml EP管中,4 °C,10000 g离心1 min。
- 弃掉上清,此时可观察到大约150 μl体积的细胞沉淀(约1× 107个细胞),此时可将细胞冻存于-80 °C冰箱中备用或者直接进行下游实验。
二、免疫共沉淀捕获Protein-RNA复合物
- 加入1 ml washing buffer重悬裂解细胞,冰置30 min,每隔5 min颠倒混匀一次。
- 加入30 μl RQI DNase,混匀,置于热混仪中,37 °C,1,000 rpm,孵育5 min,以充分消解基因组DNA。冰置5 min后,4 °C,15000 g离心20 min。
- 吸取上清于新的的EP管中,按下列比例进行分配,并加入相应的抗体,剩余上清可留作Input样品检测IP效率。400 μl IP体系加入4-10 μg antibody (Ab),Ab用量需根据抗体的IP效价进行调整,需确保Ab能够高效IP相应RBP:
Ab名称 | Ab用量(μg) | 细胞上清(μl) |
DDX17 | 5 | 400 |
IgG | 5 | 400 |
- 将EP管置于旋转混合仪上,4 °C旋转孵育2 h。
- 各取100 μl ProteinG DynaBeads于两个1.5 ml EP管中,放入磁分离架中,去上清,再加入500 μl冰预冷的washing buffer,用移液器轻柔吹打数次,放入磁分离架中静置,去上清,重复洗涤三次。
- 分别用步骤3中的DDX17或IgG孵育液重悬beads,将EP管置于旋转混合仪上,4 °C旋转孵育2 h。
- 孵育完成后将EP管置于磁分离架中,吸取并保留IP上清 (IPsup),可留作Western blotting样品检测IP效率。
- 反应结束,依次用下列预冷的缓冲液洗涤beads。洗涤方式:室温条件下使用移液器轻柔吹打数次之后,置于磁分离架上吸弃液体。
500 μl washing buffer洗涤2次
500 μl PNK buffer洗涤2次
三、RNA片段化
- 用1× MN buffer稀释MNase (Micrococcal Nuclease, MNase) 成1:1000 (1:1K, 高浓度) 和1:1000,000 (1:1M, 低浓度) (需要通过预实验摸索合适的低浓度MNase稀释比例来片段化RNA)。
- 将上述洗涤后的Beads分别按照8:1:1比例分装于新的EP管中,编号为L,S1,S2,置于磁分离架弃上清后,按下表所示加入相应的MNase消解RNA:
Beads编号MNase浓度MNase体积 (μl)
Beads编号 | MNase浓度 | MNase体积 (μl) |
L | 1:1M | 480 |
S1 | 1:1M | 60 |
S2 | 1:1K | 60 |
- 将上述EP管置于热混仪中,37 °C,1,000 rpm消解10 min。
- 反应结束,依次用下列预冷的缓冲液洗涤beads。
500 μl PNK+EGTA buffer 2次
500 μl washing buffer 2次
500 μl PNK buffer 2次 - 将S1和S2 beads置于磁分离架上去上清,于-20 °C冻存。L beads去上清后继续下游步骤。
四、去除3’末端磷酸基团
- 准备去除3’末端磷酸基团的反应体系。
10× fastAP buffer | 6 μl |
DEPC H2O | 51 μl |
FastAP | 3 μl |
Total | 60 μl |
- 各用上述反应体系60 μl重悬L beads,置于热混仪中,37 °C,1,000 rpm,15 s/3 min,孵育10 min。
- 反应结束,依次用下列预冷的缓冲液洗涤beads,洗涤方式同步骤二(8)。
500 μl PNK+EGTA buffer 洗涤2次
500μl PNK buffer 洗涤2次
五、连接3’ App-DNA linker
- 准备linker buffer
3’ App-DNA linker (20 μM) | 12 μl |
DEPC H2O | 18 μl |
Total | 30 μl |
- 各用上述linker buffer 30ul重悬beads,冰置。
- 准备连接反应体系
10× T4 RNA ligase buffer | 6 μl |
50% PEG 8000 | 12 μl |
DEPC H2O | 9 μl |
T4 Rnl2tr KQ | 3 μl |
Total | 30 μl |
- 各将上述连接反应体系30 μl加入到linker buffer重悬的beads中,置于热混仪中,1,000 rpm,15 s/4 min,25 °C反应2 h或者16 °C反应过夜。
- 用下列预冷的缓冲液洗涤磁珠,洗涤方式同步骤二(8)。
500μl PNK buffer 洗涤3次
六、32P标记RNA 5’端
- 准备标记反应体系
10× PNK buffer | 6 μl |
32P-γ-ATP | 2 μl |
DEPC H2O | 49 μl |
T4 PNK | 3 μl |
Total | 60 μl |
- 各用上述60 μl标记反应体系重悬L beads,20 μl重悬S1和S2 beads。并置于热混仪中,37 °C,1,000 rpm,15 s/4 min,孵育10 min。
- 各管补加1 μl ATP (10 mM),同样条件继续孵育10 min。
- 反应结束,用下列预冷的缓冲液洗涤磁珠,洗涤方式同步骤二(8)。
500μl PNK+EGTA buffer 3次。
七、胶分离RNA-Protein复合物及转膜
- 准备工作浓度的NuPAGE LDS buffer,L beads加入60 μl,S1和S2 beads各加入20 μl,重悬beads,同时将留存的10% Input和10% IP上清,一并置入热混仪中,70 °C,1,000 rpm,15 s/4 min,孵育10 min。
- 孵育完成,瞬间快速离心,将上清转移至新的EP管中,冰置,准备上样。
- 选用4%~12%的梯度NuPAGE Gel,配制400 ml 1× MOPS Running Buffer,冰置预冷。
- 将IP样品全部上样,每孔上样20 μl,L beads样品可上样到三个孔,冰浴条件下跑胶。调节电压80V~120V,电泳约2 h,待NuPAGE LDS BF中的溴酚蓝条带跑至底部时停止电泳 (因为其中含有未反应完的32P-γ-ATP,因此尽量不要使溴酚蓝跑出凝胶,方便放射性废物的处理)。
- 按下列配方配制1× Transfer Buffer,采用湿转装置将凝胶中的RNA-蛋白复合物转印到NC膜上。恒流250 mA,100 min (可根据转膜后凝胶上残留的放射信号和透过NC膜转印到滤纸上的放射信号来优化最佳的转膜时长。此处NC膜比PVDF膜效果更佳,需要注意NC膜不能使用甲醇浸泡激活)。
20× Trans Buffer | 25 ml |
10% SDS | 500 μl |
甲醇 | 50 ml |
DEPC H2O | 425 ml |
Total | 500 ml |
- 转膜完成后,将NC膜包裹在一层干净的保鲜膜中,放入暗夹中,在-80 °C冰箱中过夜显影 (一次可叠加3~4张X光片同时曝光,以便选取合适信号强度的结果,如果信号偏弱,可选用增感屏以增强信号强度)。
八、抽提目的蛋白结合的RNA
- 对照1:1K高浓度MNase消解样品的同位素信号,在DDX17 L beads样品 (三条lane)同样大小位置处,切取上方5~15 KDa范围内的NC膜,并将NC膜剪成小块放入新的EP管中。切取IgG样品同样大小位置的NC膜作为对照。
- 剩余的NC膜 (Input,IPsup,S1、S2 beads样品的lane) 继续孵育DDX17抗体,完成Western Blotting后续流程,以检测IP效率。
- 配制蛋白酶K工作液,置于热混仪中,37 °C,1,000 rpm,孵育20 min,以降解可能存在的核酸酶。
蛋白酶K (19.6 mg/ml) | 200 μl |
1× PK buffer | 800 μl |
Total | 1ml |
- 各取上述酶工作液200ul加入到放有NC膜的EP管中,将EP管置于热混仪中,37 °C,1,000 rpm,孵育20 min,以降解RNA-蛋白复合物中的蛋白质,将RNA释放到反应体系中。
- 配制PK+SDS buffer,各取200 μl加入到上述反应体系中,50 °C,1,000 rpm,孵育20 min,确保蛋白消解充分。
20% SDS | 10 μl |
1× PK buffer | 990 μl |
Total | 1ml |
- 向EP管中加入400 μl水饱和酚和130 μl氯仿,上下颠倒混匀,置于热混仪中,继续37 °C,1,000 rpm,孵育20 min。
- 将EP管放入4 °C离心机中,15000 g,离心20 min。
- 小心吸取溶有RNA的上层水相,转移至新的EP管中,加入50 μl醋酸钠 (3 M,pH 5.2),1 μl Glycoblue,500 μl无水乙醇和500 μl异丙醇,上下颠倒充分混匀,放入小铅罐中,并置于-80 °C冰箱中沉淀过夜。
- 取出样品,放入4 °C离心机中,18000 g,离心20 min。
- RNA沉淀非常少,肉眼几乎不可见,小心吸弃上清,缓慢加入1 ml预冷的75%乙醇,轻微颠倒EP管数次洗涤RNA沉淀,避免打散沉淀,造成RNA损失。
- 放入4 °C离心机中,18000 g,离心20 min。
- 小心吸弃上清后,瞬间高速离心,用10 μl小枪头吸尽残留液体,室温干燥5 min。
九、SuperScript III逆转录
- 准备RT primer,每管加入10 μl回溶RNA,转移至新的PCR管中。
RT primer (10 μM) | 1 μl |
DEPC H2O | 9 μl |
Total | 10 μl |
- 将PCR管放入PCR仪中,65 °C 5 min,立即冰置。
- 配制RT体系。
5× RT buffer | 4 μl |
dNTPs (10 mM) | 1 μl |
DTT (100 mM) | 1 μl |
RNAsin | 1 μl |
DEPC H2O | 2 μl |
Superscript III | 1 μl |
Total | 10 μl |
- 将上述10 μl的RT体系加入到溶解的10 μl RNA中,置于PCR仪内。设置程序:
50 °C,30 min;
55 °C,30 min;
90 °C,5 min。即获得cDNA文库。
十、去dNTPs,RT primer及RNA
- ExoSAP消解dNTPs和RT primer。RT产物中加入8 μl ExoSAP,置于PCR仪中37 °C消解15 min。消解完成后加入1 μl 0.5 M EDTA终止反应。
- 碱水解RNA。加入2.5 μl 1 M NaOH于上述反应体系中,在PCR仪中75 °C消解10 min,再加入2.5 μl 1M HCl中和体系的pH。
十一、Silane回收cDNA
- 将上述反应产物转移至1.5 ml EP管中。
- 取10 μl MyONE silane beads,加入300 μl RLT buffer吹打数次,置于磁分离架上,吸弃上清,重复洗涤两次。
- 吸取119 μl RLT buffer重悬MyONE silane beads,将其加入到cDNA反应产物中,吹打混匀,加入153 μl无水乙醇,混匀,室温孵育10 min。
- 将样品置于磁分离架上,吸弃上清,加入600 μl 75%乙醇吹打数次后,置于磁分离架上,弃上清。重复洗涤两次。
- 瞬间高速离心,吸净液体,室温晾干5 min。
十二、连接5’ DNA linker
- 准备5’ DNA linker,取10 μl重悬beads,置于热混仪中,65 °C 5 min,马上冰置。
5’ DNA linker (200 μM) | 1 μl |
DEPC H2O | 9 μl |
Total | 10 μl |
- 配制连接反应体系。
10× T4 RNA ligase buffer3 μlATP (10 mM)3 μl50% PEG 80006 μlDEPC H2O5 μlRNA ligase high conc3 μlTotal20 μl - 吸取20 μl上述连接反应体系,加入到linker重悬的beads中,混匀,置于热混仪中,1,000 rpm,15 s/4 min,25 °C反应2 h或者16 °C反应过夜。
十三、Silane回收linker-ligated cDNA
- 吸取5 μl MyONE silane beads,加入300 μl RLT buffer吹打数次,置于磁分离架上,吸弃上清,重复洗涤两次。
- 吸取105 μl RLT buffer重悬MyONE silane beads,将其加入到cDNA连接反应产物中,吹打混匀,加入135 μl无水乙醇,混匀,室温孵育10 min。
- 将样品置于磁分离架上,吸弃上清,加入600 μl 75%乙醇吹打数次后,置于磁分离架上,弃上清。重复洗涤两次。
- 瞬间高速离心,吸尽液体,室温晾干5 min。
- 吸取25 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7.5),重悬beads,室温放置10 min,使linker-ligated cDNA充分洗脱下来,将样品放入磁分离架上,吸取上清转移到新的EP管中。此即为cDNA文库。
十四、Phusion第一轮PCR扩增
- 配制如下PCR反应体系。
5× GC buffer | 10 μl |
dNTPs (10 mM each) | 1 μl |
Short xrn1 F primer (10 μM) | 2 μl |
Short xrn1 R primer (10 μM) | 2 μl |
DMSO | 1.5 μl |
DEPC H2O | 28 μl |
Phusion DNA polymerase | 0.5 μl |
cDNA template | 5 μl |
Total | 50 μl |
- 设置PCR循环程序如下:
Step 1 98 °C,30 s;
Step 2 98 °C,10 s;
Step 3 54 °C,30 s;
Step 4 72 °C,15 s;
Go to Step 2 for 15 cycles;
Step 5 72 °C,1 min。
十五、胶回收PCR产物
使用QIAEX II Gel Extraction Kit回收PCR产物,跑4%琼脂糖凝胶,回收85~125 bp范围内的PCR产物,回收产物溶解于20 μl TE buffer中。
十六、Phusion第二轮Barcode PCR产物
- 以第一轮胶回收的PCR产物做模板,进行第二轮PCR,通过反向引物引入八个碱基的barcode,从而便于多个样本混到一起进行高通量测序时,区分不同的样本数据。
- 配制如下PCR反应体系。
5× GC buffer | 10 μl |
dNTPs (10 mM each) | 1 μl |
Long xrn1 F primer (10 μM) | 2 μl |
A701R/A702R primer (10 μM) | 2 μl |
DMSO | 1.5 μl |
DEPC H2O | 28 μl |
Phusion DNA polymerase | 0.5 μl |
Template | 5 μl |
Total | 50 μl |
- 设置PCR循环程序如下:
Step 1 98 °C,30 s;
Step 2 98 °C,10 s;
Step 3 58 °C,30 s;
Step 4 72 °C,15 s;
Go to Step 2 for 5 cycles;
Step 5 72 °C,1 min。
(为避免产生过多PCR扩增产物,导致文库复杂度降低,第一轮PCR循环数的范围为15-20,第二轮PCR循环数范围为5-10。)
十七、胶回收第二轮PCR产物
使用QIAEX II Gel Extraction Kit回收PCR产物,跑4%琼脂糖凝胶,回收165~205 bp范围内的PCR产物,回收产物溶解于20 μl TE buffer中。此即为最终得到的CLIP-seq文库。(可选步骤:取1 μl文库作为模板,使用可加A的PCR酶进行扩增,回收PCR产物进行TA克隆,选取阳性克隆进行一代测序,以检查两端接头序列是否完整无误,抓到的靶序列比对到基因组上的信息等。若大部分序列可以比对到基因组上,则证明得到了较高质量的文库,可进行下一步的高通量测序)
十八、高通量测序与分析流程
测序平台及参数:Illumina Hiseq2500平台的SE50模式和HiseqX10平台的PE150模式均适用,目标数据量30 million reads。可综合考虑测序周期、价格、质量等因素选择合适的平台以及测序深度。
分析流程简述:以Hiseq2500平台的SE50模式为例,下机数据使用去接头软件,如cutadapt、trimmomatic等,去除3’接头序列。剩余序列再去掉5’末端的PCR barcode(通过5’ DNA linker引入的6个随机碱基N),保留长度大于18 nt的reads,即为clean reads。接下来用Bowtie比对软件以线粒体RNA、rRNA和tRNA作为参考序列去比对clean reads,未比对上的reads进一步以人类基因组(hg38)为参考序列去比对,可保留唯一比对的reads,进而通过call peak软件如CLIPper(https://github.com/YeoLab/clipper/),对比对上的reads进行分析,鉴定可靠的蛋白结合位点peaks及靶标RNAs。进一步可对peaks进行基序(motif)分析,如使用Homer (http://homer.ucsd.edu/homer/motif/)等软件,鉴定结合位点中富集的motifs,可作为目的RNA结合蛋白的特异性RNA基序。
结果与分析
图1展示的是不同浓度稀释梯度的Micrococcal Nuclease酶切DDX17 IP产物的结果。其中左图放射自显影结果显示:与高浓度MNase (1:1K) 处理样品相比,低浓度MNase (1:1M) 处理样品具有明显往上偏移的条带。结合右图Western blotting DDX17的条带,可以确定DDX7-RNA复合物的位置,切割回收DDX17结合的RNA并继续下游的建库测序流程。需要注意的是,如果低浓度MNase (1:1M) 处理样品相比于高浓度MNase (1:1K) 处理样品,没有明显往上偏移的条带,则说明实验没有成功,建议筛查原因并得到理想的结果后,再进行下游的建库流程。

图1. 放射自显影检测不同MNase浓度消解的DDX17-RNA复合物
失败经验
CLIP-seq实验RNA建库起始量极少,同时步骤繁多,影响RNA“质”和“量”的因素都会对实验结果造成累加影响,这是此类实验的主要难点。耐心细致的实验前准备,娴熟扎实的实验基本功都有助于得到高质量的文库。例如:通过挑选IP效率高的抗体和优化各环节实验条件、材料等以提高RNA的质量和降低建库过程的损失。
溶液配方
- Washing buffer
组分 重量/体积
10× PBS 40 ml
SDS 0.4 g
NP-40 2 ml
超纯水 to 400 ml
调节pH到7.4,用0.22 μm的滤膜过滤除菌,分装备用 - PNK buffer
组分 重量/体积
100 mM Tris-Cl (pH 7.4) 100 ml
MgCl2·6H2O 0.81 g
NP-40 2 ml
超纯水 to 400 ml
调节pH到7.4,用0.22 μm的滤膜过滤除菌,分装备用 - PNK + EGTA buffer
组分 重量/体积
100 mM Tris-HCl (pH 7.4) 100 ml
EGTA 1.52 g
NP-40 2 ml
超纯水 to 400 ml
调节pH到7.4,用0.22 μm的滤膜过滤除菌,分装备用 - MN buffer
组分 重量/体积
1 M sodium glycine (pH8.6) 1 ml
0.1 M CaCl2 1 ml
超纯水 to 10 ml
用0.22 μm的滤膜过滤除菌,分装备用。 - PK buffer
组分 重量/体积
1 M Tris-HCl (pH 7.4) 4 ml
NaCl 0.12 g
Na2EDTA 1.52 g
NP-40 2 ml
超纯水 to 40 ml
用0.22 μm的滤膜过滤除菌,分装备用 - 20× MOPS buffer
组分 重量/体积
MOPS 52.3 g
Tris 30.3 g
SDS 5.0 g
Na2EDTA 1.9 g
超纯水 to 250 ml
4 °C储存,使用时稀释成1×,现配现用 - 20× Transfer buffer
组分 重量/体积
Bicine 10.2 g
Bis-Tris 13.1 g
Na2EDTA 0.95 g
超纯水 to 125 ml
4 °C储存 - 1× Transfer buffer
组分 重量/体积
20× Transfer buffer 25 ml
10% SDS 500 μl
甲醇 50 ml
超纯水 to 500 ml
现配现用,冰预冷
致谢
该工作得到国家自然科学基金 (31922039) 的资助。该实验方案改编自本实验的发表文章Shao等 (2014) 和Jiang等 (2017),以及Nostrand等 (2016)。
参考文献
- Jiang, L., Shao, C. W., Wu, Q. J., Chen, G., Zhou, J., Yang, B., Li, H.R., Gou, L. T., Zhang, Y., Wang, Y. M., Yeo, G. W., Zhou, Y. and Fu, X. D. (2017). NEAT1 scaffolds RNA-binding proteins and the Microprocessor to globally enhance pri-miRNA processing. Nat Struc Mol Biol 24(10): 816-824.
- Nostrand, E.V., Pratt, G.A., Shishkin, A.A., Burkhart, C.G., Fang, M.Y., Sundararaman, B., Blue, S.M., Nguyen, T.B., Surka, C., Elkins, K., Stanton, R., Rigo, F., Guttman, M. and Yeo, G.W. (2016). Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods 13(6): 508-514.
- Shao, C. W., Yang, B., Wu, T. B., Huang, J., Tang, P., Zhou, Y., Zhou, J., Qiu, J. S., Jiang, L., Li, H. R., Chen, G., Sun, H., Zhang, Y., Denise, A., Zhang, D. E. and Fu, X. D. (2014). Mechanisms for U2AF to define 3’ splice sites and regulate alternative splicing in the human genome. Nat Struc Mol Biol 21(11): 997-1005.
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