全基因组siRNA法筛选环形RNA的反式调控因子
Genome-wide siRNA Screen for trans-factors of Circular RNA Regulation   

材料与试剂

1. HeLa细胞 (ATCC，产品目录号：CCL-2)
2. HEK293细胞 (ATCC，产品目录号：CRL-1573)
3. DMEM (Gibco^TM, 产品目录号: 11965092)
4. Fetal bovine serum (FBS) (Gibco^TM, 产品目录号: 10270-106)
5. 0.25% Trypsin (Gibco^TM, 产品目录号: 27250018)
6. Penicillin streptomycin (Hyclone, 产品目录号: SV30010)
7. Opti-MEM^® I Reduced Serum Medium (Gibco^TM, 产品目录号: 31985070)
8. Lipofectamine^TM 3000 Reagent (Thermo, 产品目录号: 21341)
9. Lipofectamine^TM RNAiMAX Transfection Reagent (Thermo, 产品目录号: 13778030)
10. Human ON-TARGETplus siRNA library –Genome- SMARTpool (Dharmacon)
11. doxycycline (Dox) (Clontech, 产品目录号: #631311)
12. psPAX2 (Addgene, 产品目录号: #12260)
13. pMD2.G (Addgene, 产品目录号: #12259)
14. 84消毒液
15. Phosphate buffered saline (PBS) 缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 高内涵细胞成像分析仪Operetta (PerkinElmer，Operetta高内涵细胞分析系统)
2. 自动化洗板机ELx405 (BioTek，ELx405 Select Deep Well Microplate Washer)
3. 自动化分液仪 Multidrop Combi (Thermo Fisher，Multidrop Combi自动化分液仪)
4. CO₂培养箱 (Thermo Fisher，Heracell 150i)
5. 水平离心机 (Beckman Coulter, model: Allegra X-12R)
   

实验步骤

一、构建筛选用细胞系：可诱导的circmCherry-EGFP 报告细胞系 (图1)


图1. 可诱导circmCherry-EGFP 报告细胞系的构建流程

1. 构建可诱导的circmCherry-EGFP 报告质粒
   通过分子克隆，在p23-phage 质粒的基础上插入可以过表达circmCherry和EGFP的序列。另外，为了减少背景并更好的反应新生成的环形RNA表达量的变化，将CMV 启动子替换为Dox诱导表达的pTET启动子。可诱导circmCherry-EGFP 报告质粒的具体序列见Addgene, 产品目录号: # 92351。
2. 包装可诱导circmCherry-EGFP 报告质粒的慢病毒
   
   2.1

   转染前24 h于3.5 cm培养皿中预铺30%汇合度的HEK293细胞；
   2.2

   用50 μl Opti-MEM稀释4 μl Lipofectamine 3000并混匀；用50 μl Opti-MEM稀释 4 μl P3000, 1 μg pHAGE-EF1⍺-IRES-mCherry，0.75 μg psPAX2和0.25 μg pMD2.G并混匀；
   2.3

   将稀释的质粒加入稀释的Lipofectamine 3000中，混匀并室温静置15 min；
   2.4

   将质粒-脂质体复合物逐滴、均匀地加入到细胞中；
   2.5

   6 h后更换新的DMEM完全培养基;
   2.6

   分别于24 h、48 h收集两次病毒上清液，病毒液经混匀后1,000 × g离心5 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤后离心浓缩并分装。
3. 在HeLa传代过程中，将上述包装好的慢病毒加入DMEM完全培养基中，悬浮感染HeLa细胞。
4. HeLa细胞感染4天后，加入1 μg/mL dox诱导circmCherry和EGFP表达。诱导表达24小时后，通过流式分选同时带有绿色荧光和红色荧光的HeLa细胞。
5. 将流式分选拿到的同时带有绿色和红色荧光的HeLa细胞收集，并以每500个细胞接种到一个10cm培养皿里面，培养箱正常培养10天后，单个细胞来源的克隆长大至肉眼可见，再将单克隆分别转移至多孔板里面单独培养扩增。后续进一步挑选带有合适绿色、红色荧光的细胞系，即为筛选用的可诱导circmCherry-EGFP 报告细胞系。
   
   

二、全基因组siRNA文库筛选 (图2)


图2. Human siGENOME SMARTpool siRNA library 筛选流程

经过前期转染条件的优化，确定最适转染条件为：在384孔板中，使用Lipofectamine^TM RNAiMAX 0.1 μl/孔，细胞接种密度 500个/孔，转染48 h后，加入1 μg/mL dox诱导24 h，然后进行荧光表型检测。
siRNA转染的具体操作步骤如下：

1. 阴性对照组的制备：
   
   1.1

   使用1x siRNA buffer 稀释Non-targeting Pool siRNA至0.1 μM；
   1.2

   在第二列孔中加入Non-targeting Pool siRNA (0.1 μM)，10 μl/孔，设置为阴性对照组。
2. 转染试剂的制备：
   
   2.1

   用Opti-MEM按照体积比1: 100稀释Lipofectamine^TM RNAiMax；
   2.2

   使用自动化分液仪 Multidrop Combi将上述转染试剂溶液加入siRNA板内 (第2列至第23列)，10 μl/孔；
   2.3

   水平离心机100 × g离心1 min，将siRNA与RNAiMax混匀
   2.4

   室温静置20 min。
3. 细胞悬液的制备：
   
   3.1

   将可诱导的circmCherry-EGFP 报告细胞系消化后配制成浓度为500个细胞/30 μl DMEM完全培养基的悬液。
   3.2

   使用自动化分液仪 Multidrop Combi将上述细胞悬液加入siRNA板 (第2列至第23列)，30 μl/孔；
   3.3

   为减少边缘效应，在384孔板第1列及第24列加入50 μl DMEM。
4. 将加好转染试剂和细胞的384板经水平离心机中100 × g离心2 min，放置于CO₂培养箱中培养48 h。
5. 将Dox用DMEM完全培养基稀释至6 μg/ml。使用自动化分液仪 Multidrop Combi将Dox加入siRNA板 (第1列至第24列)，10 μl/孔。
6. 将加好Dox的384板经水平离心机中100 × g离心2 min，放置于CO₂培养箱中继续培养24 h。
   
   

三、表型检测

1. 加入Dox 24 h后，使用PBS及自动洗板机ELx405清洗细胞3次 (抽吸30 μl 1x PBS并补充新的30 μl 1x PBS，重复3次)，最后将培养基置换为1x PBS；此步骤的目的是降低由培养基导致的成像背景信号值过高，从而提高图像信噪比。
2. 使用Operetta高内涵成像分析仪对清洗后的384板成像 (10倍长工作距离物镜，GFP和mCherry双通道) (图3)。
3. 利用Harmony软件进行图像定量分析，分别计算各孔GFP和mCherry的平均荧光强度。
   
   
   图3. 筛选结果中代表性的384孔板成像图片
   

结果与分析

筛选的384板经Operetta成像的结果中，第2列为Scramble组 (阴性对照组)；第3列至第22列为siRNA处理组。成像数据经Operetta采集、自动化分析可得出量化的荧光数值，这些数据经过合理的分析 (图4) 得到初步的筛选结果，具体流程如下：


图4. 筛选结果的初步数据分析步骤及结果

1. 利用Scramble组的GFP和RFP荧光值分别标准化各siRNA处理组的荧光值。将两次生物学重复的筛选结果值取平均，总共18，104个基因具有荧光值。
2. 根据HeLa的RNA二代测序结果去除初步筛选结果中不表达的基因，保留9，249个表达基因的荧光值。
3. 去除影响EGFP表达的基因，阈值设定为：0.67 < EGFP < 1.5，保留6，876个基因的荧光值。
4. 筛选影响mCherry的基因：上调的阈值设定为：mCherry > 1.5，下调的阈值设定为：mCherry < 0.67，总共筛选到787和1,053个基因分别导致红色荧光上调和下调。
5. 为了鉴定直接影响circRNA的反式因子，对找到的787和1,053个基因进行基因聚类分析，最终鉴定到103个RNA结合蛋白。
6. 后续利用其他方法进行单个验证。 例如，通过shRNA敲低筛选鉴定到的NF90和NF110两个蛋白，均能发现circmCherry的表达量明显下调(图5)，说明这两个蛋白对于circRNA的生成有促进作用，与筛选结果一致。
   
   
   图5. 筛选结果的初步验证。敲低NF90和NF110影响了circmCherry的表达。
   

溶液配方

1. 1x PBS，配置后调整pH值为7.2 ~ 7.4并过滤灭菌
   

   NaCl	8 g
   Na2HPO4	2.9 g
   KCl	0.2 g
   KH2PO4	0.2 g
   ddH2O补至1 L

致谢

本实验在生化细胞所化学生物学平台完成，得到化学生物学平台工作人员的大力帮助。另外本实验得到了中国科技部 (2016YFA0100701、2014CB964802)、中国科学院 (XDB19020104)、国家自然科学基金 (91440202、91540115)和霍华德·休斯医学研究所 (55008728) 的支持。此方法已被使用，相应研究成果被发表在Molecular Cell (Li et al., 2017)。

参考文献

1. Li, X., Liu, C. X., Xue, W., Zhang, Y., Jiang, S., Yin, Q. F., Wei, J., Yao, R. W., Yang, L. and Chen, L. L. (2017). Coordinated circRNA biogenesis and function with NF90/NF110 in viral infection. Mol Cell 67(2): 214-227 e217.