摘要:Hippo信号通路广泛参与器官大小调控、组织稳态、癌症发生发展等过程,该通路失活时,关键组分YAP去磷酸化,进入细胞核并调节下游靶基因的转录,促进细胞生长和癌症的发生。为了找到Hippo信号通路负调控因子,我们选取Human ON-TARGETplus (OTP) 全基因组siRNA文库进行筛选,以YAP入核抑制率作为筛选指标。首先在胃癌细胞系HGC-27中转染不同的siRNAs,运用免疫荧光呈像技术检测YAP的亚细胞定位,最后通过计算机程序对荧光图像进行统计分析,定量YAP出入核的变化,获得Hippo信号通路负调控因子。
关键词: Hippo信号通路, YAP入核抑制率 , 负调控因子 , siRNA高通量筛选 , 胃癌
材料与试剂
- 15 ml离心管 (Corning, catalog number: CLS430791)
- 50 ml离心管 (Corning, catalog number: CLS430828)
- 10 ml移液管 (Corning, catalog number: 4488)
- 1.5 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
- 96孔圆底板 (Corning, catalog number: CLS3879)
- 384孔Viewplate黑色透明底板 (Perkin Elmer, catalog number: 6007460)
- RPMI 1640 (Thermo, catalog number: 11875093)
- Opti-MEM (Thermo, catalog number: 31985088)
- FBS (Biological Industries, catalog number: 04-001-1A)
- Trypsin-EDTA (0.25%) (Thermo, catalog number: 25200072)
- Penicillin/streptomycin (Thermo, catalog number: 15070063)
- Lipofectamine RNAiMAX reagent (Thermo, catalog number: 13778075)
- PFA (Sigma-Aldrich, catalog number: 158127)
- Triton X-100 (Sigma-Aldrich, catalog number: 93443)
- BSA (生工生物工程(上海)股份有限公司,catalog number: 9048-46-8)
- DharmaFECT1 (Horizon,catalog number: T-2001-03)
- TOX (Thermo, catalog number: AM16708)
抗体
- YAP (63.7) antibody (Santa Cruz, catalog number: sc-1001199)
- Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse secondary antibody (Thermo, catalog number: A32723)
- DAPI (Sigma-Aldrich, catalog number: 28718-90-3)
细胞系
HGC-27细胞 (上海生命科学研究院细胞资源中心,TCHu 22)
仪器设备
- 离心式自动洗板机 (BlueCatBio,model: BlueWasher)
- Multidrop自动分液器 (Thermo Fisher,model: Multidrop Combi)
- Opera激光共聚焦高内涵细胞成像分析系统 (Perkin Elmer,model: Opera LX488/561/640)
- Operetta高通量细胞成像分析系统 (Perkin Elmer,model: Operetta)
- 隔水式恒温培养箱 (上海精宏实验设备有限公司)
- 水平冷冻离心机 (Eppendorf,model: 5810R)
- 细胞计数仪 (Invitrogen,model: Countess)
- 二氧化碳恒温细胞培养箱 (Thermo Fisher,model: Thermo Series 8000)
- 电动移液器 (Eppendorf)
- Ensight多功能微孔板检测仪 (Perkin Elmer,model: Ensight)
- Bravo自动化液体处理平台 (Agilent,model: Bravo)
实验步骤
一、预实验:
在本实验中,我们选择胃癌细胞系HGC-27作为实验对象,进行最佳细胞密度、转染试剂类型及转染试剂浓度的测试 (图1)。由于Hippo信号通路受细胞密度的影响,细胞密度低的情况下,Hippo信号通路被抑制,YAP入核;细胞密度高的情况下,YAP在细胞质中 (Zhao et al., 2007; Ota and Sasaki, 2008)。因此,我们选择在低细胞密度的情况下进行筛选Hippo通路的负调控因子。
- 测试条件:
细胞密度梯度:每孔250、500、750、1,000个细胞。
转染试剂:RNAiMAX和DharmaFECT1。
转染试剂浓度:每孔0.05、0.1和0.15 μl。
NC:negative control siRNA。
TOX:用于检测转染效率。
转染时间:48小时。
图1. 384孔板测试条件分布
- 实验步骤
二、高通量筛选:
- 选择Human ON-TARGETplus (OTP) siRNA亚文库:GPCR、Phosphatase和Protease等亚文库。利用Bravo自动化液体处理平台进行亚文库整版分装,每块整版3个重复,每孔加入10 μl siRNA。
- 用Multidrop自动分液器加样,每孔10 μl RNAiMAX液体 (0.05 μl RNAiMAX + 9.5 μl Opti-MEM),800 rpm水平离心1分钟,室温静置混合15分钟后,加入30 μl HGC-27细胞 (250个/孔),800 rpm水平离心1分钟使细胞沉降至板底,放入37 °C培养箱中培养48小时。
- 免疫染色方法见上面实验步骤第(6)步。
- 使用Opera或者Operetta进行拍照,用Columbus软件进行荧光强度计算和统计。
结果与分析
本实验根据YAP在细胞质和细胞核内的荧光强度比值进行分类,定义细胞质荧光强度/细胞核荧光强度>1.25的为YAP定位在细胞质,定义细胞质荧光强度/细胞核荧光强度≤1的为YAP定位在细胞核 (比例数值大小根据实验具体荧光强度可稍做调整)。随后计算加入siNC和不同siRNA后YAP在细胞质中的细胞数目/总细胞数 (cyto ratio),用siRNA (cyto ratio) – siNC (cyto ratio) 即为加入不同siRNA后的YAP入核抑制率。以亚文库Phosphatase筛选为例,利用GraphPad Prism 8.0软件进行图像处理,将处理后所得数据导入软件XY Table中作图,横坐标为基因数目,纵坐标为YAP入核抑制率,得到YAP入核抑制率≥30%以上的基因数6个,即这6个基因敲低后能够促进YAP的出核 (图11)。
图11. 亚文库Phosphatase中各个基因敲低导致YAP入核的抑制率大小
失败经验
- 细胞生长密度影响实验结果:
- 处理结果无法得到正确的YAP在细胞质和细胞核的数目
解决方案一:调整YAP在细胞质和细胞核的荧光强度的定义,修改计算荧光强度的范围;解决方案二:对比荧光图片预览区域,调整细胞质荧光强度/细胞核荧光强度的比值大小范围,得到正确的分群信息。 - 实验过程中关键步骤的影响实验结果
溶液配方
- 1640完全细胞培养液
16.7% FBS, penicillin/streptomycin (v/v: 1:100)加入到1640基础培养基中
4 °C保存,使用前37 °C水浴加热。 - PBS缓冲液
8 g NaCl,0.2 g KCl,14.2 g Na2HPO4,0.27 g KH2PO4,加入800 ml双蒸水溶解,用HCl调pH值至7.4,加水定容至1 L
0.22 μm滤膜过滤后,高压蒸汽灭菌,室温或4 °C保存。 - 5% BSA
5 g BSA用PBS缓冲液溶解并定容至100 ml,0.22 μm滤膜过滤,4 °C保存。 - 0.05% Triton X-100
50 μl Triton X-100用PBS缓冲液溶解并定容至100 ml
0.22 μm滤膜过滤,4 °C保存。 - YAP (63.7) 抗体稀释
按1:250的稀释倍数,溶解至5% BSA中,4 °C保存。 - Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse 二抗稀释
按1:1,000的稀释倍数,溶解至5% BSA中,4 °C保存。 - DAPI稀释
按1:1,000的稀释倍数,溶解至5% BSA中,4 °C保存。 - PBA溶液
PBS缓冲液中加入0.5% BSA配制,4 °C保存。
致谢
感谢中国科学院分子细胞科学卓越中心化学生物学技术平台对本实验方法的帮助和改进。本实验得到国家自然科学基金项目 (81822035, 82002493) 和中国博士后科学基金项目(2020T130477)的资助。
参考文献
- Ota, M. and Sasaki, H. (2008). Mammalian Tead proteins regulate cell proliferation and contact inhibition as transcriptional mediators of Hippo signaling. Development 135(24): 4059-4069.
- Zhao, B., Wei, X., Li, W., Udan, R. S., Yang, Q., Kim, J., Xie, J., Ikenoue, T., Yu, J., Li, L., Zheng, P., Ye, K., Chinnaiyan, A., Halder, G., Lai, Z. C. and Guan, K. L. (2007). Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev 21(21): 2747-2761.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:汤扬, 焦石, 周兆才. (2021). 胃癌细胞中Hippo通路负调控因子筛选-YAP出入核检测. // 高通量筛选实验手册.
Bio-101: e1010822. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010822.
How to cite: Tang, Y. Jiao, S. and Zhou, Z. C. (2021). Screening of Negative Regulators of Hippo Pathway in Gastric Cancer Cells with Nuclear Translocation of YAP as Readout. // High-throughput Screening Protocol eBook.
Bio-101: e1010822. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010822.