胃癌细胞中铁死亡调控因子筛选—PI/ Hoechst染色法
Screening of Ferroptosis Regulators in Gastric Cancer Cell—PI/Hoechst Staining   

材料与试剂

1. 15 ml离心管（Corning, catalog number: CLS430791）
2. 50 ml离心管（Corning, catalog number: CLS430828）
3. 10 ml移液管（Corning, catalog number: 4488）
4. 1.5 ml离心管（Axygen, catalog number: MCT-150-C）
5. 96孔圆底板（Corning, catalog number: CLS3879）
6. 384孔黑色板（Corning, catalog number: COR-3712）
7. RPMI 1640（Thermo, catalog number: 11875093）
8. Opti-MEM（Thermo, catalog number: 31985088）
9. FBS（Biological Industries, catalog number: 04-001-1A）
10. Trypsin-EDTA（0.25%）（Thermo, catalog number: 25200072）
11. Penicillin/streptomycin（Thermo, catalog number: 15070063）
12. Lipofectamine RNAiMAX reagent（Thermo, catalog number: 13778075）
13. RSL3 reagent（MCE, catalog number: HY-100218A）
14. Ferrostatin-1 reagent（MCE, catalog number: HY-100579）
15. DMSO reagent（Sigma, catalog number: D2650）
16. Propidium Iodide reagent（Thermo, catalog number: P3566）
17. Hoechst 33342 reagent（Thermo, catalog number: P3570）
18. 1640完全细胞培养液（见溶液配方）
19. PBS缓冲液（见溶液配方）
    
    

细胞系
HGC-27细胞（上海生命科学研究院细胞资源中心，TCHu 22）

仪器设备

1. Multidrop自动分液器（Thermo Fisher，model: Multidrop Combi）
2. 隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）
3. 水平冷冻离心机（Eppendorf，model: 5810R）
4. 细胞计数仪（Invitrogen，model: Countess）
5. 二氧化碳恒温细胞培养箱（Thermo Fisher，model: Thermo Series 8000）
6. 电动移液器（Eppendorf）
7. Ensight多功能微孔板检测仪（Perkin Elmer，model: Ensight）
8. 非接触式数码滴定仪（Tecan，model: D300e）
9. Beckman大型液体工作站（Beckman，model: Biomek FX^P）
   

实验步骤

       在本实验中，我们选择胃癌细胞系HGC-27作为实验对象，利用已报道的铁死亡诱导剂RSL3和抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）进行铁死亡调节因子筛选 (Bersuker et al., 2019; Doll et al., 2019)。

1. 选择Human ON-TARGETplus（OTP）全基因组siRNA亚文库进行筛选，使用Beckman大型液体工作站将亚文库siRNAs铺至 384孔板中，用Opti-MEM稀释siRNA至终浓度为20 nM，每孔加入10 μl siRNA。
2. 用Multidrop自动分液器进行RNAiMAX试剂加样，每孔10 μl体系（0.1 μl RNAiMAX/孔 + 9.9 μl Opti-MEM）。
3. 加入siRNA和RNAiMAX试剂后，800 rpm水平离心1分钟，室温静置30分钟，使两者充分混匀。
4. 在siRNA和RNAiMAX试剂静置过程中，准备细胞。用Trypsin-EDTA（0.25%）将HGC-27细胞消化后，用1640完全培养基重悬细胞，随后利用细胞计数仪进行细胞计数，用Multidrop自动分液器加细胞，每孔加入30 μl对应密度的细胞量（1,000个细胞每孔）。（由于血清的终浓度为10%，用Opti-MEM配制siRNA和转染试剂中未加入血清，因此在1640完全培养基中的血清浓度为16.7%）。
5. 每孔加入对应密度的细胞后，800 rpm水平离心1分钟，使细胞沉降在板底。随后将384孔板放置在含有5% CO₂的37 ℃培养箱中培养48小时。
6. 用Ensight多功能微孔板检测仪进行明场拍照，观察每个孔之间细胞密度的差异，排除细胞密度对后续实验的影响。
7. 自动化加药：
   使用非接触式数码滴定仪进行加药，RSL3和Fer-1终浓度为0.2 μM和1 μM。加样设置如图1，灰色区域加入RSL3。红色部分加入RSL3和Fer-1是做为阳性参照，Fer-1可以部分rescue由RSL3诱导的铁死亡，促进胃癌细胞的存活率。
8. 加药后，800 rpm水平离心1分钟，将384孔板放置在含有5% CO₂的37 ℃培养箱中培养24小时。
9. PI/ Hoechst染色：使用Multidrop自动分液器进行加样，5 μl每孔，用完全培养基进行稀释，PI/Hoechst终浓度1:1,000稀释。染色后，37°培养箱中孵育15-20分钟。
10. 用Ensight多功能微孔板检测仪进行PI/Hoechst拍照，计算每组的细胞数目，得到细胞存活率。
    
    
    图1. 整板加药设置
    

结果与分析

Hoechst染色后计数：细胞总数
PI染色后计数：死细胞数目
siNC存活率（%）：[1-（siNC死细胞数目/siNC细胞总数）]*100%
siRNA存活率（%）：[1-（siRNA死细胞数目/siRNA细胞总数）]*100%
存活比例值= siRNA存活率（%）/ siNC存活率（%）
将存活比例值与每组重复之间的p-value值进行作图，如图2所示，分析即可得到铁死亡候选调节因子。


图2. 铁死亡调控因子筛选结果

失败经验

1. 预实验时需要摸索细胞密度和铁死亡诱导剂RSL3浓度，细胞不能过稀或者过密。不同细胞对铁死亡诱导剂RSL3敏感程度不一样，做筛选之前需要测试细胞对RSL3的IC₅₀值，选择合适的RSL3浓度，将细胞存活率控制在30%左右。此步是影响筛选成败的关键步骤，需要做好预实验。
2. PI/Hoechst染色时间不易过长，时间过长会导致细胞死亡，影响实验结果，因此在PI/Hoechst染色这一步建议前一块板子染色拍照后再进行下一块板子的染色。
   

溶液配方

1. 1640完全细胞培养液
   16.7% FBS, penicillin/streptomycin（v/v: 1:100）加入到1640基础培养基中，4 °C保存，使用前37 °C水浴加热。
2. PBS缓冲液
   8 g NaCl，0.2 g KCl，14.2 g Na₂HPO₄，0.27 g KH₂PO₄，加入800 ml双蒸水溶解，用HCl调pH值至7.4，加水定容至1 L，0.22 μm滤膜过滤后，高压蒸汽灭菌，室温或4 °C保存。
   

致谢

感谢中国科学院分子细胞科学卓越中心化学生物学技术平台对本实验方法的帮助和改进。本实验得到国家自然科学基金项目（81725014, 81822035）以及中国博士后科学基金（2020T130477） 的资助。

参考文献

1. Bersuker, K., Hendricks, J. M., Li, Z., Magtanong, L., Ford, B., Tang, P. H., Roberts, M. A., Tong, B., Maimone, T. J., Zoncu, R. et al. (2019). The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis. Nature 575(7784): 688-692.
2. Doll, S., Freitas, F. P., Shah, R., Aldrovandi, M., da Silva, M. C., Ingold, I., Goya Grocin, A., Xavier da Silva, T. N., Panzilius, E., Scheel, C. H. et al. (2019). FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor. Nature 575(7784): 693-698.