摘要: 细胞活力检测技术已广泛应用于分子生物学、遗传学、肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力学等研究领域。检测细胞存活与增殖的方法主要包括观察DNA合成含量和检测细胞代谢活性等。ATP参与生物体内多种酶促反应,是活细胞新陈代谢的常规指标,其含量直接反应了细胞的数量及细胞状态,与活细胞数成正相关。CellTiter-Glo (CTG)发光法是目前常用的细胞活力检测手段,通过定量ATP来确定存活细胞的数量,被设计用于多孔板工作模式,是细胞增殖和细胞毒性高通量筛选分析的理想选择。CTG发光法灵敏度高,信号持续时间长,实验操作方便快捷,只需较少的细胞量即可完成。CTG发光法检测系统中需要的试剂和细胞培养中的常用培养基兼容,如RPMI1640、MEM、DMEM和 Ham's F12等,也不受酚红和有机溶剂的影响,误差小,准确率高。我们以HCT116细胞为例,通过siRNA文库转染及CTG化学发光检测,建立了可用于鉴定细胞活力调控基因的高通量筛选体系。
关键词: 细胞增殖技术 , ATP, CellTiter-Glo, HCT116, siRNA文库, 高通量筛选
材料与试剂
- DMEM培养基(元培生物,货号:L110KJ,4℃保存)
- 1 x PBS
- OPTI-MEM(Gibco,货号:31985-070)
- 0.25%胰酶(Gibco,货号:25200-072)
- 细胞计数板
- 84消毒液
- 灭菌双蒸水
- Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen,货号:13778-100,4℃保存,不可以冻存)
- DharmaFECT 1(GE,货号:T-2001-03)
- Negative control siRNA (NC,Dharmacon, 货号:D-001810-10-05)
TOX Transfection Control ( Dharmacon,货号:D-001500-01-05) - 5x siRNA Buffer (Dharmacon,货号:B-002000-UB)
- RNase-free water (Qiagen,货号:129117)
- CellTiter-Glo(Promega,货号:G756A,-20℃保存)
- 96孔板(Corning,货号:3610)
- 0.22 μm 滤器
- 60 ml注射器
仪器设备
- 37℃ 5% CO2细胞培养箱
- 细胞计数仪
- 自动分液器(Thermo,仪器型号:Multidrop Combi)
- 水平离心机(Eppendorf,仪器型号:5810R)
- 多功能微孔板检测仪(PerkinElmer,仪器型号:Ensight)
- 多标记微孔板检测仪(PerkinElmer,仪器型号:Envision)
- 排枪,移液枪,移液器(Eppendorf)
实验步骤
本课题工作通过前期探索性实验以及测序分析得到一些可能参与调控细胞增殖及存活的候选基因,以HCT116细胞为研究对象,我们对其中的一部分基因用siRNA文库转染的方法进行敲减,一定时间以后通过检测CTG读值变化分析候选基因是否影响细胞生长。由于候选基因数量不多(<100个),且除了最后收集CTG数据外还希望获取整个实验过程中的细胞生长曲线,因此本实验选用96孔板进行siRNA文库筛选实验。
- 筛选体系建立及优化
为建立最优的筛选实验体系,我们测试并优化了多种实验条件,主要包括:细胞接种密度、CTG检测阈值、CTG用量、siRNA转染试剂及用量。
- siRNA库筛选正式实验
我们根据前期测序结果挑选出若干候选基因,每个基因4条不同的siRNA,每条siRNA设置3个复孔。具体的实验步骤如下。
结果与分析
- CTG检测阈值
依据上述实验步骤进行完实验后,对实验数据进行分析,结果如图2所示。在96孔板中铺8个不同量的HCT116细胞,贴壁后第二天在显微镜下观察显示20000个左右细胞的密度在80%左右,而30000以上的细胞就基本长满已经有接触抑制了。从CTG曲线可以看出,20000个细胞也在CTG检测的线性范围内,且100 μl培养基中加50 μl和100 μl CTG效果基本一致,50 μl稍微敏感一些。正式实验时我们打算培养96 h,因此推算出起始细胞量在1000-2500之间比较合适,CTG的检测加50 μl即可。
图3. CTG检测阈值结果
- siRNA转染条件优化
根据预实验设计,两种转染试剂RNAiMax和DharmaFECT 1各三种不同的用量0.1,0.15和0.2 μl/孔,在CTG检测阈值范围内起始细胞数设置1000、1500、2000和2500个/孔四个条件。
siRNA转染HCT116后培养96 h测出的CTG曲线如下图3到图6。图3和图4是将转染NC对照组和只加1 x siRNA稀释缓冲液的对照组在不同实验条件下的CTG值进行比较分析两种转染试剂对HCT116细胞的毒性,CTG曲线结果表明转染试剂的用量越多,细胞毒性越高。图5和图6是将转染siTOX实验组和只加1x siRNA稀释缓冲液的对照组在不同实验条件下的CTG值进行比较分析两种转染试剂对HCT116细胞的转染效率,图中结果表明转染试剂的用量越多,转染效率也越高。综合转染毒性和转染效率,以及CTG的线性检测阈值,我们最终确定HCT116细胞96孔板每孔初始细胞量为1500个,0.15 μl/孔 RNAiMax转染试剂,为siRNA转染最优条件。
图4. 转染试剂RNAiMax细胞毒性分析
图5. 转染试剂DharmaFECT 1细胞毒性分析
图6. 转染试剂RNAiMax转染效率分析
图7. 转染试剂DharmaFECT 1转染效率分析
- 筛选影响细胞生长的基因
总结分析实验数据,计算每块板的阴性对照NC的CTG数值平均值,再将相应板的每个孔CTG数值除以NC组的平均值得到一组新的数值,TOX的数值越小说明转染实验做的越好。分析归类出与NC有差异的基因,大于1的说明敲低该基因后促进细胞生长,小于1的说明敲低该基因后抑制细胞生长。筛选出候选基因后,后续再用其他实验辅助验证。
溶液配方
- 1 x PBS
用双蒸水稀释10 x PBS获得 - 10% 84消毒液
用双蒸水稀释84原液获得,再用0.22 μm滤器过滤制备 - DMEM培养基
500 ml培养基加10% FBS和1%氨苄青霉素/链霉素溶液 - 灭菌双蒸水
将双蒸水121 ℃高压灭菌20 min获得 - siNC/siTOX溶液
用1 x siRNA Buffer将siRNA储存液稀释100倍,每个孔加10 μl - CTG试剂制备
提前溶解CTG缓冲液并平衡至室温,将冻干状态的CTG底物也置于室温,用CTG缓冲液溶解冻干状态的酶/底物混合物,温和的震荡混匀即配制成CTG试剂
注意事项
- 室温溶解siRNA时不要将孔板摞在一起,否则会由于板子上下温度不一致而导致溶液挥发至封板膜上,不容易被离心至孔内。
- 自动化分液仪 Multidrop Combi加样时要根据体积选择合适的分液盒,速度设置要合适。由于分液盒长期使用是磨损型耗材,加样前要用移液器确认实际体积与目的体积是否有偏差。另外由于吹打混匀以及管子里需要充盈液体,因此需要比实际需要加样的总体积多配一些溶液,细分液盒至少需要1 ml,粗分液盒至少需要7 ml。
- 正式筛选实验时,每块siRNA板子都需要设置阴性和阳性对照,数据处理时都是跟同一块板的阴性对照NC比较。
- Envision的检测对体积有要求,液体不可以太多否则容易溢出污染aperture(信号检测相机的光圈)。运用96孔板进行筛选实验,液体体积在150-200 μl均可。
- 由于ATP易水解,加入CTG试剂的整个检测实验操作过程中应该特别注意避光。
致谢
本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金面上项目(资助号:81972260,81772599)的经费支持。实验技术方面得到了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台的韩帅老师和慈云青老师的悉心指导。
参考文献
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J. and Fletcher, J. (1993). The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J Immunol Methods 160(1): 81-8.
- Kangas, L., Grönroos, M. and Nieminen, A. L. (1984). Bioluminescence of cellular ATP: A new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med Biol 62(6): 338-43.
- Cree, I. A., Pazzagli, M., Mini, E., Mazzei, T., Hunter, E. M., Sutherland, L. A., Pinzani, P., Gerli, A. and Andreotti, P. E. (1995). Methotrexate chemosensitivity by ATP luminescence in human leukemia cell lines and in breast cancer primary cultures: Comparison of the TCA-100 assay with a clonogenic assay. Anticancer Drugs 6(3): 398-404.
- 白志军 和 狄飚. (2015). Celltiter-Glo ATP荧光活性检测在登革病毒1型中和试验中的应用. 江苏预防医学 1(5): 16-8.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:陈敏, 骆大葵, 韩帅, 李心翔, 高大明. (2021). siRNA文库筛选细胞活力调控因子---CellTiter-Glo法. // 高通量筛选实验手册.
Bio-101: e1010825. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010825.
How to cite: Chen, M., Luo, D. K., Han, S., Li, X. X. and Gao, D. M. (2021). siRNA Library Screening of Regulatory Factors of Cell Viability—CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay. // High-throughput Screening Protocol eBook.
Bio-101: e1010825. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010825.