摘要:线粒体膜电位的高低可以反应线粒体功能的完整性,是反应线粒体功能状态的重要指标之一。四甲基罗丹明甲酯 (tetramethylrhodamine methyl ester;TMRM) 是一种细胞渗透性阳离子亲脂性红色荧光染料,其进入细胞后,被细胞内酯酶切离,产生四甲基罗丹明。四甲基罗丹明进入线粒体后,被线粒体俘获,分布和结合在线粒体内膜上,呈现强烈荧光。线粒体膜电位的高低变化决定了TMRM的分布浓度。电位高,TMRM在线粒体的浓度高,显示为强力红色或桔红色;反之,TMRM弥散在胞浆内,荧光减弱表明线粒体膜电位受到损害。(Creed and McKenzie, 2019)。 棕榈酸 (palmitate,PA) 作为一种动植体内常见的高级饱和脂肪酸,已被发现可以通过其脂毒性诱导细胞凋亡。PA造成的脂毒性会引起细胞线粒体膜的去极化,膜电位降低 (Jun et al., 2011)。本实验在细胞内转染miRNA mimics后,加入可导致细胞线粒体膜电位损伤的PA,然后利用TMRM染色检测红色荧光强度以指征线粒体膜电位的高低,使用Operetta CLSTM (PerkinElmer,USA) 对细胞中的荧光进行信号采集和定量,通过基于图像的高内涵筛选 (high content screening, HCS) 分析从而筛选可以缓解或加重PA导致的线粒体膜电位损伤的miRNAs (Massey, 2015)。
关键词: 线粒体膜电位, TMRM, 棕榈酸 (PA), Operetta CLSTM
材料与试剂
- 96 Well Black Assay Plate, Clear Bottom with Lid, 3603 (Corning Costar, Cambridge, MA, catalog number: 04119005)
- HepG2细胞 (ATCC, USA)
- Opti-MEM (Gibco,catalog number: 11058021)
- Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, catalog number: 13778075)
- miRNA mimics (上海吉玛制药技术有限公司)
- MEM/EBSS培养基 (Hyclone, Logan, UT, USA,catalog number: AF29549370)
- Penicillin/Streptomycin (Gibco, Germany,catalog number: 15240-062)
- 四甲基罗丹明甲酯TMRM (Sigma, catalog number: T5428)
- CCCP (Sigma, catalog number: C2759)
- Hoechst 33342 (上海翌圣生物科技有限公司,Yeason,catalog number: 40731ES10)
- 20x PBS (上海生工生物工程有限公司,catalog number: B548117)
- DMSO (Sigma, catalog number: BCBZ1685)
- 棕榈酸钠Sodium palmitate (Sigma, catalog number: P9767)
- BSA,Fatty Acid Free牛血清白蛋白 (上海翌圣生物科技有限公司,Yeason,catalog number: 9048-46-8)
- 200 μM TMRM (见溶液配方)
- 1 mM CCCP (见溶液配方)
- 10 mg/ml Hoechst 33342储存液 (见溶液配方)
- MEM/EBSS完全培养基 (见溶液配方)
- 1x PBS (见溶液配方)
- 10 mM PA (见溶液配方)
- 9% BSA (见溶液配方)
仪器设备
- PerkinElmer Operetta CLSTM (PerkinElmer, USA)
- 移液器 (Eppendorf)
实验步骤
- 转染与铺细胞
- 药物处理
- TMRM染色
- 高内涵成像
结果与分析
首先在HepG2细胞给予不同浓度的PA (0.05 mM,0.1 mM,0.2 mM,0.5 mM) 处理24 h,摸索导致膜电位损伤的合适浓度。结果表明,CCCP处理30 min可明显降低TMRM荧光强度,导致线粒体膜电位损伤 (图1 A)。不同浓度PA也可导致膜电位降低,但0.5 mM PA处理条件下,细胞死亡较多,造成的线粒体损伤较严重,miRNA mimics可能无法有效逆转该损伤,故选用0.2 mM PA作为诱导膜电位损伤的条件进行高内涵筛选 (图1 B)。
图 1. PerkinElmer Operetta CLSTM 采集荧光信号 A. 阳性对照CCCP处理HepG2细胞,TMRM荧光图及荧光强度定量;B. 不同浓度PA处理HepG2细胞,TMRM荧光图及荧光强度定量。
失败经验
- 由于将Hoechst与TMRM共孵育30 min,所以Hoechst的浓度不能过高,否则会导致细胞核过曝,影响统计结果。
- 用PBS洗去剩余染料时,应该动作尽量轻,否则会导致细胞被吹起,影响实验结果。
- TMRM及Hoechst染色时,可能会存在杂质及死细胞等的异常染色,因此在分析荧光强度时可以在"filter by property"方法下通过设定intensity范围来筛选阳性细胞,排除阴性结果。
溶液配方
- 200 μM TMRM:用DMSO溶解配成200 μM母液,-20 °C避光保存。
- 10 mM CCCP:用DMSO溶解配成10 mM母液,-20 °C避光保存,配置成母液后尽量在一个月内使用。
- Hoechst 33342储存液:用无菌超纯水溶解配制10 mg/ml Hoechst 33342的储存液,-20 °C避光保存。
- MEM/EBSS完全培养基:
MEM/EBSS培养基 450 ml
FBS 50 ml
Penicillin/Streptomycin 5 ml
- 1x PBS:
取50 ml 20x PBS加入ddH2O并定容至1 L,高压蒸汽灭菌,冷却后室温保存。
- 10 mM PA:
称取27.841 mg 棕榈酸钠 (Sodium palmitate),加入1 ml PBS中,70 °C加热溶解成100 mM的母液;称取2 g不含脂肪酸的BSA溶解于20 ml PBS中,55 °C加热;将 1 ml PA母液加入9 ml BSA中,55 °C加热至溶液澄清即得到10 mM PA,冻存于-20 °C,使用时用培养基稀释至所需浓度。
致谢
感谢中国科学院上海药物研究所李佳老师课题组对该实验方法的PerkinElmer Operetta CLSTM仪器设备的支持。基金项目 (Foundation):国家科技部"重大新药创制"科技重大专项 (No 2018ZX09101001-003-007)。
参考文献
- Creed, S. and McKenzie, M. (2019). Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). In: Haznadar M. (Ed.). In: Methods in molecular biology. Humana Press, New York, NY. ISBN: 9781493990276.
- Jun, D. W., Cho, W. K., Jun, J. H., Kwon, H. J., Jang, K. S., Kim, H. J., Jeon, H. J. , Lee, K. N., Lee, H. L., Lee, O. Y., Yoon, B. C., Choi, H. S., Hahm, J. S. and Lee, M. H. (2011). Prevention of free fatty acid-induced hepatic lipotoxicity by carnitine via reversal of mitochondrial dysfunction. Liver Int 31(9): 1315-1324.
- Massey, A. J. (2015). Multiparametric cell cycle analysis using the operetta high-content imager and harmony software with PhenoLOGIC. PLoS One 10(7): e0134306.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:麻宁宁, 陈静, 任进. (2021). 利用高内涵筛选系统进行线粒体膜电位检测 (TMRM染色). // 高内涵成像及分析实验手册.
Bio-101: e1010834. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010834.
How to cite: Ma, N. N., Chen, J. and Ren, J. (2021). Mitochondrial Transmembrane Potential (ΔΨm) Detection Using High Content Screening System. // High-Content Imaging and Analysis Protocol eBook.
Bio-101: e1010834. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010834.