摘要:三维多细胞肿瘤球体模型(Three-dimensional Multicellular Tumor Spheroid,MCTS)具有和在体肿瘤组织相似的立体结构,可模拟肿瘤内特殊微环境及肿瘤细胞的生物学特性,这些因素均会影响抗肿瘤药物的药动-药效行为。相比于单层培养的细胞模型,MCTS能更加准确地反映药物在实体瘤内的作用,是体外药物筛选评价的理想模型之一。该文旨在阐述基于MCTS的药动-药效评价的相关方法,为基于MCTS的高通量药物筛选提供技术支持。
关键词: 三维多细胞肿瘤球体模型, 抗肿瘤药物, 药动-药效评价
材料与试剂
一、材料
- 移液器:10 μL(Eppendorf Research®, catalog number: 3120000224);200 μL (Eppendorf Research®, catalog number: 3120000259);1 mL (Eppendorf Research®,catalog number: 3120000267);
- 枪头:10 μL(Axygen®, catalog number: AXYT300);200 μL (Axygen®, catalog number: AXYT200Y);1 mL (Axygen®, catalog number: AXYT1000B);
- 离心管:15 mL(Axygen®, catalog number: AXYSCT15ML25S);1.5 mL (Axygen®, catalog number: AXYMCT150C);
- 移液管(Corning®, catalog number: CLS4488);
- 细胞培养瓶(Corning®, catalog number: CLS430168);
- 96孔细胞低吸附U底板(SUMILON PrimeSurfaceTM, catalog number: MS-9096UZ)。
二、试剂
- 胎牛血清(Gibco® 10091-148);
- 无血清培养基(根据细胞种类,选择相应培养基);
注1:“结果与分析”项中涉及的HepG2人肝癌细胞株用DMEM培养基 (Gibco® , catalog number: 10313-021),MCF-7人乳腺癌细胞株用RPMI1640培养基 (Gibco®, catalog number: A10491-01)。
- 细胞培养用抗生素(10,000 U/ mL 青霉素与链霉素, Gibco®, catalog number: A15140-122);
- PBS缓冲液(碧云天, catalog number: ST447);
- 2% 异戊二醛(Sigma-Aldrich, catalog number: 354400);
- Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测试剂 (碧云天, catalog number: C0039);
- 0.25% 胰蛋白酶溶液(Merck, catalog number: 59428C);(Merck, catalog number: 59428C);
- RPMI1640完全培养基(见溶液配方);
- DMEM完全培养基(见溶液配方)。
仪器设备
- 高压灭菌锅(HITACHI SX-700);
- 生物安全柜(Thermo Fisher Scientific 1384);
- Lionheart™ FX 智能活细胞成像分析系统(BioTek);
- 二氧化碳培养箱(Thermo Fisher Scientific 3111);
- 离心机(Eppendorf® Centrifuge Mini Spin)。
实验步骤
一、三维多细胞肿瘤球体模型(MCTS)的培养
- 培养密度的筛选
将消化好的细胞按照1,000、2,500、5,000、7,500、10,000、15,000 个/孔的密度接种于细胞低吸附处理产品PrimeSurfaceTM 96 U型板,晃动混匀后,放置于培养箱。72 h后隔天对半换液。LionheartTM FX 智能活细胞成像分析系统实时监测不同接种密度下,MCTS的圆度、直径、面积、透光率及相对体积随时间变化规律,考察最优细胞接种密度。
- 培养时间的筛选
确定细胞密度后,通过扫描电镜考察不同培养时间下MCTS的立体结构及生理状态。以最优密度接种细胞,收集培养5、8、11、14天的MCTS。一部分直接固定于2 % 异戊二醛,扫描电镜检测MCTS的三维立体形态;另一部分在显微镜下用手术刀片沿中轴线切开后固定,检测时选取各样本中垂直摆放的MCTS,观察不同培养天数下,MCTS的内部细胞及外部细胞的生理状态。以MCTS外周细胞状态良好 (细胞膜完整且细胞饱满)而中心细胞呈调亡坏死状态(细胞膜破损且细胞皱缩)为标准,确定适宜的培养时间。
二、基于三维多细胞肿瘤球体模型的药效评价
- 待测药物配制
配制一系列浓度的储备液(1000x),于无菌环境下用无血清培养基稀释至目标给药浓度。
- 给药
用200 μL枪头将96孔板中的培养基吸取干净,弃掉原有培养基后,加入200 μL含药培养基。
注2:将96孔板一边微微抬起,呈一定角度面朝实验者侧放,200 μL枪头小心吸取培养基,且注意不碰触MCTS。可通过肉眼观察孔底是否留有MCTS或者吸取液体内是否带有MCTS,判断操作是否准确。
注3:考虑到后续实验MCTS可能因操作遗失,在给药时,每个浓度一般设置大于8个复孔(n > 8)。
- CCK-8法检测
达到给药时间终点后,用200 μL枪头小心吸弃含药培养基。每孔加入90 μL无酚红无血清的培养基以及10 μL CCK-8反应溶液,轻摇混合均匀。同时在空白无细胞孔中加入相同溶液,设置空白对照,检测CCK-8反应溶液本底。于37 °C避光反应一定时间后,于450 nm波长处测定吸光度值(A)。
细胞生长抑制率计算公式如下:
注4:在三维多细胞肿瘤球体模型实验中,CCK-8反应时间一般为2 h。当对照不给药组吸光度小于0.8时,可于37 °C继续避光孵育,适当延长CCK-8的反应时间。
三、基于三维多细胞肿瘤球体模型的摄取动力学评价
- MCTS的富集
考虑到单个MCTS内药物含量无法达到常规药物浓度检测方法(LC-MS/MS等)的检测下限,基于MCTS的摄取动力学评价将6个MCTS体富集为一个样本。用1 mL枪头将6个MCTS逐一吸取至无菌1.5 mL离心管,待用。可根据给药方案,准备所需的富集样本。
- 给药
用200 μL枪头小心吸弃1.5 mL离心管中的培养基,加入0.5 mL含药培养基。盖紧管盖后,食指指腹轻轻敲打1.5 mL离心管数次,使MCTS从管底悬浮起来,勿过于用力破坏MCTS结构。而后放入37 °C细胞孵育箱中孵育。
- 终止实验
达到给药终点后,800 × g离心,使MCTS沉落于1.5 mL离心管底部,200 μL枪头小心吸弃含药培养基。加入4 °C PBS 1 mL,食指指腹轻轻敲打1.5 mL离心管数次,使MCTS从管底悬浮起来,荡洗管壁和MCTS表面残留的含药培养基。 800 × g离心,使MCTS沉落于1.5 mL离心管底部,200 μL枪头小心吸弃PBS。根据后续药物检测需求处理样本,或将样本冻于-80 °C待用。
结果与分析
一、基于HepG2 MCTS评价常用小分子药物阿霉素(DOX)和紫杉醇(PTX)的药动-药效行为。(Liu et al., 2017)
- HepG2 MCTS的构建与验证
考察不同接种密度、不同培养时间下,HepG2细胞的成球情况,筛选构建MCTS的最适培养条件并对其生理生化状态进行验证。
首先,我们考察了不同的细胞接种密度对MCTS成球能力的影响。如图1(A)所示,以2.5x103个/孔的密度接种,MCTS的圆度不佳;以5x103个/孔的密度接种,MCTS的相对厚度不佳;当接种密度达到7.5x103个/孔及以上时,各接种密度下MCTS的圆度及相对厚度并无明显差异。考虑到相同厚度的情况下,以7.5x103个/孔接种的MCTS的直径和平面面积明显小于以10x103或15x103 个/孔接种的MCTS,平均相对圆度维持在0.9以上,三维立体结构更趋向于球形,因此后续实验选取7.5x103 个/孔作为最适接种密度。之后,我们对培养时间进行了筛选, 如图1(B)所示,培养8天时MCTS外层细胞状态良好,而培养时间延长至13天或18天时,外周区域细胞会出现融合增多、表面绒毛减少的损伤现象,MCTS总体状态不佳。因此,实验选取7.5 x 103 个/孔,培养7-8天作为HepG2成球的最适条件。该培养条件下,可形成直径为500 µm的HepG2 MCTS(图1(C)),且立体结构良好(图1(D))。HE染色及Ki67免疫组化结果 (图1(E)) 显示培养所得HepG2 MCTS外周区域细胞增殖旺盛、生理状态良好;而中心区域细胞增殖能力下降、出现凋亡、坏死的现象,具有和在体肿瘤组织相似的生理状态。
图 1. HepG2 MCTS的构建与验证。(A)以不同密度接种HepG2细胞,实时观察不同接种密度下,相对圆度、相对厚度、相对直径、相对面积和相对体积随培养时间的变化规律;(B)沿中轴线切割MCTS后,通过扫描电镜检测MCTS内部及外周区域细胞的生理状态;7500个HepG2细胞培养7天后,分别用明场显微镜(C)和扫描电镜(D)观察HepG2 MCTS的平面及三维形态。 (E)MCTS和肿瘤切片的H&E染色和Ki67染色。数据以平均值(mean)± 标准误(SEM)表示。
- DOX和PTX在HepG2 MCTS的药动-药效行为
当HepG2细胞由二维 (单层细胞,SLC)向三维(细胞球,MCTS)转化后,其对抗肿瘤药物DOX和PTX的敏感度显著下降。DOX在SLC的IC50值为0.703 µM,而在MCTS的IC50值为9.714 µM(图2(A));PTX在SLC的IC50值为0.022 µM,而在MCTS的IC50值为0.136 µM(图2(B))。
与药效结果一致,MCTS对DOX、PTX的摄取速率及程度显著低于SLC(图2(C-D))。相同给药剂量下,DOX在SLC的饱和累积量为9.013 ± 0.4413 nmole/mg protein而在MCTS的饱和累积量为3.505 ± 0.3833 nmole/mg protein,两者相差2.57倍。对于PTX而言,其在SLC的饱和累积量为1.005 ± 0.0165 nmole/mg protein,而在MCTS的饱和累积量则为 0.5794 ± 0.0163 nmole/mg protein,两者相差1.73倍。
图 2. DOX和PTX在HepG2 MCTS的药动-药效行为。给予不同浓度DOX(A,单层细胞模型的给药浓度为 0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、5.0、10.0 µM;多细胞球体模型的给药浓度为2、5、10、20、30、40、50、60、70 µM)或PTX(B,单层细胞模型的给药浓度为0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 µM;多细胞球体模型的给药浓度为 0.05、0.1、0.2、0.5、2.5、5、10、25、50 µM),给药72 h 后,CCK-8法检测SLC和MCTS的细胞存活率。分别给予10 µM DOX(C)或5 µM PTX(D),于给药 1、2、4、8、16、24 h,LC-MS/MS检测SLC和MCTS内的药物浓度。数据以平均值(mean)± 标准误(SEM)表示。
二、基于MCF-7 MCTS评价人参皂苷Rh2对阿霉素(DOX)药动-药效行为的影响。(Liu et al., 2020)
- MCF-7 MCTS的构建与验证
参照“结果与分析” 项一(1)的筛选方法,最终确定以5 x 103个/孔接种MCF-7细胞,培养8天,可得三维形态良好、和肿瘤组织生理状态相似的MCF-7 MCTS (图3)。
图 3. MCF-7 MCTS的构建与验证。以5 x 103个/孔的密度接种MCF-7细胞,实时观察MCTS形态(A),以及相对圆度、相对厚度、相对直径、相对面积和相对体积(B)随培养时间的变化规律;用5 x 103个HepG2细胞培养8天后,通过HE染色(C)和扫描电镜(D)考察MCF-7 MCTS内部及外周区域细胞的生理状态。数据以平均值(mean)± 标准误(SEM)表示。
- 预给予Rh2增加DOX在MCF-7 MCTS的细胞毒作用及胞内累积量
预给予Rh2不同时间(24 h、48 h和72 h)可显著增强MCTS对DOX的敏感性及 摄取能力。随着Rh2预处理时间的增加,DOX在MCTS的半数抑制浓度(IC50)逐渐降低,在细胞内的积累量逐渐增加(图4)。
图 4. Rh2对DOX在MCF-7 MCTS的药动-药效行为的影响。(A)预给予5 µM Rh2不同时间(24、48、72h)后,撤去Rh2,再给予不同浓度DOX(0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300 µM)72h,CCK-8法检测不同给药方案对MCF-7 MCTS的生长抑制作用;(B)不同给药方案在MCT-7 MCTS模型上的半数抑制浓度;(C)预给予5 µM Rh2不同时间(24、48、72h)后,撤去Rh2,再给予10µM DOX,于1、4、8、16、24 h后,LC-MS/MS检测MCF-7 MCTS内DOX的浓度,并计算胞内药物浓度-时间曲线的曲线下面积(Area Under Curve,AUC)。数据以平均值(mean)± 标准误(SEM)表示, 与单用DOX组相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
溶液配方
- RPMI1640完全培养基
市售无血清RPMI1640培养基 + 10%胎牛血清 + 抗生素(100 U/mL)
无菌环境配制,4 °C冷藏,注意密封,1个月内使用;
- DMEM完全培养基
市售无血清DMEM高糖培养基 + 10%胎牛血清 + 抗生素 (100 U/mL)
无菌环境配制,4 °C冷藏,注意密封,1个月内使用。
致谢
感谢国家自然科学基金青年项目(81803625)和江苏省自然科学基金青年项目(BK20180558)的资助。
参考文献
- Liu, J., Cai, Q., Wang, W., Lu, M., Liu, J., Zhou, F., Sun, M., Wang, G. and Zhang, J. (2020). Ginsenoside Rh2 pretreatment and withdrawal reactivated the pentose phosphate pathway to ameliorate intracellular redox disturbance and promoted intratumoral penetration of adriamycin. Redox Biol 32: 101452.
- Wang, W., Cai, Q., Zhou, F., Liu, J., Jin, X., Ni, P., Lu, M., Wang, G. and Zhang, J. (2018). Impaired pentose phosphate pathway in the development of 3D MCF-7 cells mediated intracellular redox disturbance and multi-cellular resistance without drug induction. Redox Biol 15: 253-265.
- Liu, J., Yan, F., Chen, H., Wang, W., Liu, W., Hao, K., Wang, G., Zhou, F. and Zhang, J. (2017). A novel individual-cell-based mathematical model based on multicellular tumour spheroids for evaluating doxorubicin-related delivery in avascular regions. Br J Pharmacol 174(17): 2862-2879.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:敖路遥, 张可心, 周芳, 张经纬, 刘嘉莉. (2021). 基于三维多细胞肿瘤球体模型的药动-药效评价. // 高通量筛选实验手册.
Bio-101: e1010838. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010838.
How to cite: Ao, L. Y., Zhang, K. X. Zhou, F., Zhang, J. W. and Liu, J. L. (2021). The Pharmacokinetics-Pharmacodynamics Evaluation Based on Three-dimensional Multicellular Tumor Spheroid. // High-throughput Screening Protocol eBook.
Bio-101: e1010838. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010838.