利用表面等离子共振成像技术高通量筛选表观遗传相互作用
High Throughput Screening of the Epigenetic Interactome by Surface Plasmon Resonance Imaging (SPRi)   

材料与试剂

1. 擦镜纸 (杭州宁泰造纸有限公司，西湖牌，规格10 × 15 cm，100张)
2. 10 cm培养皿 (Corning, catalog number: 2629088)
3. 裸金芯片 (Plexera Bioscience, NanoCapure, catalog number: PX100)
4. 光学清洗液 (Fisher Scientific, catalog number: 22-143974)
5. 折射率匹配液 (Cargille Laboratories, catalog number: 1809)
6. 琥珀酸酐 (SAA) (Sigma-Aldrich, catalog number: 239690)
7. 二甲氨基吡啶 (DMAP) (Sigma-Aldrich, catalog number: 107700)
8. 二甲基甲酰胺 (DMF) (国药集团化学试剂北京有限公司，catalog number: 81007780)
9. 羟基末端烷硫醇 (EG3-OH) (ProChimia Surfaces, catalog number: TH 001-m11.n3)
10. 光交联剂 (photo-cross-linker，PCL) (TCI, catalog number: T2820)
11. 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC) (Sigma-Aldrich, catalog number: 03450)
12. N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) (Sigma-Aldrich, catalog number: 56480)
13. 乙醇胺 (EA) (国药集团化学试剂北京有限公司，catalog number: 40021361)
14. 乙醇 (EtOH) (国药集团化学试剂北京有限公司，catalog number: 100092188)
15. DMSO (Sigma-Aldrich, catalog number: 34943)
16. TBS缓冲液 (见溶液配方)
17. PBS缓冲液 (见溶液配方)
18. PBST缓冲液 (见溶液配方)
19. 重生液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 等离子清洗仪 (四川威斯派克科技有限公司，铭恒牌，model: PDG-MG)
2. 生物芯片点样仪 (Arrayit corporation, model: SpotBot 3 Microarray Printer)
3. 真空干燥器 (Merck, model: Millivac Vacuum Pump & Nalgene vacuum desiccator)
4. 紫外交联仪 (北京宾达科技有限公司，model: UVJLY-I)
5. 高通量生物分子相互作用分析仪 (Plexera Bioscience, model: PlexArray HT)
6. Plexera软件系统 (Plexera Bioscience, Plexera Instrument Control仪器控制软件，Plexera Data Explorer数据分析软件)
   

实验步骤

一、SPRi实验原理及流程示意图 (图1)

表面等离子共振成像 (Surface plasmon resonance imaging，SPRi) 技术是一种光学传感技术，其原理基于SPR，但利用电荷耦合器 (Charge couple device, CCD) 摄像机采集芯片表面图像信息。当入射角固定时，流动相分子与芯片表面固定相分子发生结合和解离所引起的SPR信号变化会表现为反射光的强度变化。通过平行光源入射，即可在芯片表面固定多种生物分子，在反射光方向利用CCD同时进行大面积的平行信号的采集，将反射光强的变化转换成图像的灰度值，从而进行分子相互作用的高通量实时检测。
SPRi的实验流程为，芯片的制备，微阵列打印固定相分子，芯片装载和SPRi仪器调试，SPRi检测数据收集，数据处理及结果分析。


图 1. SPRi实验原理及流程示意图(引自Zhao et al., 2017)

二、三维卡宾芯片的制备(改编自Wang et al., 2015)

1. 将裸金芯片放入等离子清洗仪中清洗3 min，然后用去离子水和乙醇交替清洗3次，氮气吹干。
2. 将芯片浸泡在合成好的高分子溶液中，孵育1 h，让末端带有巯基的高分子组装在金表面，然后将芯片用去离子水和乙醇交替清洗，氮气吹干。
3. 将修饰有高分子的芯片放入含有10 mg/ml琥珀酸酐 (SAA) 和15 mg/ml 二甲氨基吡啶 (DMAP) 的二甲基甲酰胺 (DMF) 溶液中，酸化2 h。
4. 将芯片分别放入DMF，去离子水，乙醇各摇洗30 min，氮气吹干备用。
5. 酸化好的芯片浸入含有1 mM 羟基末端烷硫醇 (EG3-OH) 的乙醇溶液中孵育1 h，封闭高分子链之间的裸金表面。
6. 将芯片表面高分子的末端羧基基团用新鲜配置的EDC/NHS (0.4 M/0.1 M) 混合液活化15 min后，用去离子水简单清洗，氮气吹干。
7. 浸入10 mM 光交联剂 (PCL) 的DMF溶液中孵育4 h。
8. 将芯片浸入1 M 乙醇胺 (EA) 的DMF溶液中封闭掉未反应的活化羧基。
9. 将芯片在DMF，去离子水和乙醇中各摇洗15 min，氮气吹干，放在-20 °C冰箱中避光保存。
   

三、微阵列芯片的制备

1. 按照生物点样仪的操作说明设定相应的点样程序。
2. 将待筛选分子库的分子和阴性对照以阵列的形式打印在三维卡宾芯片上 (由于卡宾基团的高活性和短寿命，点样过程尽量避光操作)。
3. 点样完成后，将芯片放置在真空干燥箱内真空干燥30 min (可适当延长时间，直到样点干燥)。
4. 将芯片放置在紫外交联仪内，进行光交联反应30 min (UV波长365 nm ，能量为2.8 J/cm²)。
5. 分别用PBST，PBS，去离子水摇洗芯片15 min。
   

四、SPRi进行分子相互作用检测

1. 系统开机，将TBS缓冲液，重生液和待测样品依次放入仪器中对应位置。装载维护芯片，运行Prime System，用缓冲液冲洗整个管路系统并且排除系统中可能残留的气泡。
2. 将带有微阵列的芯片与流通池利用夹具装置组装好 (图2)。用沾有光学清洗液的镜头纸轻轻地擦拭棱镜和组装好的实验芯片的玻璃面，保证没有油渍与灰尘。卸除维护芯片，将实验芯片安装至芯片固定装置上。在棱镜表面中心滴1滴折射率匹配液，轻轻地按下芯片固定装置。在Load Instrument中观察芯片表面是否有气泡，如果有气泡需要重新进行擦拭、滴油、装载和观察。 确定没有气泡后，运行Prime Flow Cell，使得芯片流通池中充满缓冲液。
   
   
   图 2. 芯片组装示意图及配套的组装夹具
   
   
3. 调整光学位置设置SPR角。点击Set SPR angle，进入光学系统设置界面。运行Start进行SPR angle sweep共振角扫描。
4. 在Assign ROI页面选择感兴趣的点，选点尽量点在打印点的中心处。最后一个点为背景点选在空白打印处。选点完成后观察基线位置，一般在40-90 AU之间，如果超出此范围，应该手动调整光学位置设置SPR角，使基线回到此区间。
5. 实验方法设置。通常实验起始会设置三轮重生液和缓冲液交替清洗芯片表面的步骤，直到基线平稳。进样程序设置包括基线 (2 μL/s，180 s)；结合 (2 μL/s，300 s)；解离 (2 μL/s，300s)；重生 (3 μL/s，200 s)。本实验一共8种样品，每种样品用缓冲液配成5个浓度梯度至少700 μL体积。在Method Builder Table中检查实验样品的顺序，以及样品所对应的EP管位置。系统会在Method Builder Table下方显示完成实验所需时间，预计完成时间以及保存视频需要的硬盘大小。再次确认样品放置正确和重生液缓冲液的量足够，点击Run运行。实验数据在下方窗口Real-time Sensorgram中进行实时监测并显示。
6. 整个实验过程由仪器控制软件记录，数据处理采用Plexera Data Explorer软件完成。
   

结果与分析

1. 成功制备了三维卡宾芯片并将125种组蛋白修饰多肽 (浓度为1 mM，溶于去离子水) 和3种阴性对照 (分别为PBS, TBS, ddH₂O) 在三维卡宾芯片上通过光交联的方法固定，每个样品重复点样三次，形成三个重复区域Block1/2/3 (图3)。
   
   
   图 3. 固定多肽微阵列的三维卡宾芯片在SPRi仪器上的成像图(引自Zhao et al., 2017)
   
   
2. 待测样品分别为7种H3K4me3阅读器 (CHD1, TAF3, JMJD2A, SGF29, ZCWPW1, JARIDA1A和ING2) 和1种H3K9me3阅读器 (HP1)。每种样品以5个浓度梯度依次进样检测，单次进样同时流经芯片上的Block1/2/3区域，相当于进行了三次平行实验。根据SPRi实验数据提取这1000对相互作用的结合解离曲线进行拟合，并按照亲和力绘制热图。为了防止由于非特异结合出现的假阳性信号，还引入了重生校正 (Regeneration calibration) 对数据进行质控 (图4)。通过对阳性对照和阴性对照的结果分析 (图5)，证明SPRi高通量筛选相互作用的结果可信度。
   
   
   图 4. 利用SPRi对1000对组蛋白多肽-组蛋白阅读器相互作用高通量筛选的亲和力热力图，左右两侧分别为重生校正前/后的结果，排除了一些假阳性结果(引自Zhao et al., 2017)
   
   
   图 5. SPRi高通量筛选中己知阳性互作的验证 (a) JARIDIA．ZCWPWl，JMJD2A和HPI的结合曲线。对H3K4me3多肽的结合曲线用红色表示；对H3K9me3多肽的结合曲线用绿色表示；对非修饰组蛋白多肽的结合用蓝色表示。(b) 阳性对照的5个浓度结合曲线拟合结果。(引自Zhao et al., 2017)
   
   
3. 进一步对结果中的4种带有不同修饰的组蛋白多肽[H3_(1–15)K4un, H3_(1–15)K4ac, H3_(1–15)K4me1, and H3_(1–15)K4me3]与5种组蛋白甲基化阅读器 (TAF3, CHD1, JARID1A, ZCWPW1, and JMJD2A) 之间的相互作用动力学拟合曲线 (图6) 进行分析，证明了通过SPRi高通量筛选实验可以对不同的亲和力强弱进行对比，并且能获得一些结合动力学的信息 (表1)。所有的亲和力数值均由三组平行实验得到。
   
   
   图 6. SPRi高通量检测带有不同修饰的H3(1–15)K4多肽与不同组蛋白阅读器的结合动力学曲线(引自Zhao et al., 2017)
   
   表 1. SPRi实验获得的表观遗传相互作用(组蛋白阅读器和组蛋白多肽)的结合动力学和拟合的亲和力常数(引自Zhao et al., 2017)
   
   
   综上，利用SPRi技术结合微阵列打印技术和三维卡宾芯片光交联固定技术，可以实现对于蛋白-蛋白相互作用分析的高通量筛选。该方法还可以进一步扩展到其它生物大分子 (如核酸) 的相互作用以及生物大分子和小分子之间相互作用的高通量筛选中。
   

失败经验

1. 样品信息
   实验开展前，首先要确定样品信息，才能更好地设计实验。需要明确浓度 (摩尔浓度)、溶剂或建议缓冲液。
   对于固定在芯片上的样品需求如下：
       a.  小分子：点样浓度为5-10 mM，体积10-20 μL，一般DMSO溶解。
       b.  多肽：点样浓度1-5 mM，体积10-20 μL，一般DMSO或者ddH₂O溶解。
       c.  核酸：点样浓度为0.1-1 mM，体积10-20 μL，一般ddH₂O溶解。
       d.  蛋白：点样浓度0.5-1 μg/μL，体积10-20 μL，一般PBS溶解。
   对于待进样检测的蛋白样品需求：浓度最好有1 μM，体积至少0.7 mL，对于多浓度实验体积至少1.4 mL。
2. 芯片选择
   对于小分子化合物、多肽和DNA/RNA，选择卡宾芯片进行光交联固定，对于蛋白类大分子样品可以选择葡聚糖羧基芯片通过氨基偶联的方法进行固定。
   
3. 缓冲液选择
   流动相缓冲液的选择最好和待检测样品的缓冲液保持一致，以免由于成分变化而造成SPR信号的变化。
   一般的蛋白样品缓冲液有PBS、PBST、TBS等，通常正式上机实验前要配制至少500 mL的缓冲液。
   流动相缓冲液中最好不要含有DTT (二硫苏糖醇)、β-ME (β-巯基乙醇) 等还原剂成分，会破坏芯片的表面化学结构，导致实验失败。同时也要避免甘油等折射率很高的成分，保证其含量不超过5%。
   
4. 样品浓度梯度配制
   选择好适合的缓冲液后，如果希望获得比较准确的结合动力学数据，一般推荐从1 μM起始浓度进行等倍稀释，通常至少设置5个浓度梯度。
   
5. 重生液选择
   重生液一般选择10 mM甘氨酸盐酸 (pH 1.5-3.0，可以通过重生实验选择合适的pH值)，或50 mM 氢氧化钠，实验前准备250 mL以上。重生的目的是在不破坏芯片表面固定分子的同时把结合上的生物大分子洗脱下来，方便进行下一步的结合实验。
   
6. 由于气泡会引起芯片表面信号发生巨大变化，在实验过程中整个管路和流通池中要保证充满液体无气泡，因此进行实验前所有缓冲液都要进行0.22 μm滤膜过滤及脱气处理，管路和流通池也要通过Prime程序充分润洗。

溶液配方

1. TBS缓冲液
   称取2.42 g Tris (MW:121.14)，5.84 g NaCl (FW:58.44)
   加入900 mL的去离子水
   溶解后浓盐酸调pH至7.5
   加去离子水定容至1 L
   超声除气，4 °C保存
   
2. PBS磷酸盐缓冲液
   称取0.24 g磷酸二氢钾，1.44 g磷酸氢二钠，8 g 氯化钠，0.2 g氯化钾
   加入900 mL的去离子水
   溶解后浓盐酸调pH至7.4
   加去离子水定容至1 L
   超声除气，4 °C保存
   
3. PBST缓冲液
   配制1x PBS磷酸盐缓冲液500 mL
   加入250 μL Tween20
   充分混匀，超声除气，4 °C保存
   
4. 重生液10 mM的甘氨酸盐酸，pH = 2.0
   称取0.75 g甘氨酸 (MW:75.08)
   加入900 mL的去离子水
   溶解后浓盐酸调pH至2.0
   加去离子水定容至1 L
   超声除气，4 °C保存
   

致谢

感谢清华大学李海涛实验室和国家纳米中心朱劲松实验室给予的建议和帮助。本文实验方案改编自2017年发表在PNAS杂志上的文章 (Zhao et al., 2017)。感谢清华大学结构生物学高精尖创新中心的经费支持和蛋白质研究技术中心蛋白质制备与鉴定平台提供仪器支撑服务。

参考文献

1. Zhao, S., Yang, M., Zhou, W. F., Zhang, B. C., Cheng, Z. Q., Huang, J. X., Zhang, M., Wang, Z. Y., Wang, R., Chen, Z. L., Zhu, J. S. and Li, H. T. (2017). Kinetic and high-throughput profiling of epigenetic interactions by 3D-carbene chip-based surface plasmon resonance imaging technology. P Natl Acad Sci USA 114(35): E7245-E7254.
2. Wang, Y. M., Wang, C. X., Cheng, Z. Q., Zhang, D. D., Li, S. P., Song, L. S., Zhou, W. F., Yang, M., Wang, Z. Y., Zheng, Z., Han, B. H., Wang, C., Yang, Y. L. and Zhu, J. S. (2015). SPRi determination of inter-peptide interaction by using 3D supramolecular co-assembly polyrotaxane film. Biosens Bioelectron 66: 338-344.