无菌条件下贴壁细胞换液的Bravo自动化液体处理平台参数设置
Parameter Setting of Bravo Automated Liquid Handling Platform for Adherent Cells Medium Exchange Under Sterile Condition   

材料与试剂

1. DMEM培液 (HyClone, Catalog Number: SH 3024301)
2. TRYPSIN-EDTA (0.25%) (Gibco, Catalog Number: 25200056)
3. 384孔黑边底透板 (Corning, Catalog Number: 3764)
4. 96孔PP材质板 (Corning, Catalog Number: 3879)
5. 15 ml离心管 (NEST, Catalog Number: 601002)
6. 50 ml离心管 (NEST, Catalog Number: 602002)
7. Multidrop仪器标准管分液盒 (Thermo, Catalog Number: 24072671(0))
8. 细胞计数片 (BodBoge细胞计数仪配置)
9. 移液管 (Corning, Catalog Number: 4488)
10. 100 mm细胞培养皿 (NEST, Catalog Number: 704001)
11. 70 µl384孔Bravo仪器移液头盒 (Fluotics, Catalog Number: AGI-P70.ST)
    

仪器设备

1. BodBoge细胞计数仪 (上海祥合医疗器械有限公司，型号: JSY-SC-021H)
2. Multidrop Combi自动分液器 (Thermo Fisher Scientific，型号: Multidrop Combi)
3. Bravo自动化液体处理平台 (Agilent Technologies，型号: Bravo)
4. 高速离心机 (Eppendorf，型号: Centrifuge 5810R)
5. Ensight多功能微孔板检测仪 (PerkinElmer，型号: Ensight Multimode Plate Reader)
6. 37 °C恒温培养箱 (Thermo Fisher Scientific，型号: SERIES 8000 DH)
   

实验步骤

1. 接种细胞
   293-T细胞用胰酶消化后，悬浮于含10%胎牛血清DMEM培液的15 ml离心管中，取10 μl细胞悬液使用BodBoge细胞计数仪记取个数，然后计算细胞合适接种量，再使用Multidrop自动分液器，按每孔1,000个细胞接种于384孔板，微孔板每孔加入55 μl细胞液，129 × g离心2 min，然后放置于37 °C，5%CO2培养箱孵育72 h。
   
2. 使用Bravo仪器进行细胞换液操作
   
   2.1

   打开层流净化罩紫外灯，光照30分钟后，打开风机，达到无菌效果。
   2.2

   在Bravo电脑控制软件里编写程序。
           整个程序流程是从细胞板里吸液，加入到盛装废液的微孔板中，然后从含新鲜培养液的微孔板中吸取培养液，加到细胞板中。下文所叙述的是从细胞板里吸液和往细胞板里加液的参数设置情况。
   2.3

   设置从384孔细胞板里吸液程序。
   
   
   图1. Bravo操作软件中吸液Task Parameters显示图
   
           图1显示的是从细胞板里吸液的Aspirate Task Parameters。
           在Aspirate Task Parameters设置中，Volume选择60 μl，即从细胞板里吸取培养液体积，Well selection选择所需吸取培养液的细胞板内列数（本文实验中，移液头按列排列一次性获取8根移液头吸液或加液，也即做8个复孔）。
           另外，影响吸液效果的关键参数主要包括：1. Liquid class，2. Distance from well bottom。其中Aspirate Liquid class参数中主要包含Aspirate Parameters设置（图2），它包括Velocity、Acceleration和Post-aspirate delay，在此次实验中，主要调节前两项参数（见表1）。
   
   
   图2. Bravo操作软件中Aspirate Parameters显示图
   
   表1. Aspirate Liquid Class参数设置
   

   	①	②	③	④	⑤	⑥
   Velocity(0.1-500 μl/s)	1	5	10	50	100	500
   Acceleration(1-1,000 μl/s2)	1	5	10	50	100	500

   
           吸液参数优化思路：先选定表1中Aspirate Parameters最低速度和加速度条件（见表1条件①，也即Velocity: 1 μl/s，Acceleration: 1 μl/s2），调节Distance from well bottom（移液头距细胞板底高度），由0.5、1、1.5、2、2.5和3 mm依次变化，观察细胞贴壁情况。根据实验结果及实验需求，选择合适的Distance from well bottom。根据这个高度，变化不同的Aspirate Parameters参数设置（见表1，①②③④⑤⑥6种条件），观察细胞贴壁情况及考虑实验所需时间，选择合适的Aspirate Parameters和Distance from well bottom参数设置。
   2.4

   找到合适的吸液参数条件后，确定向细胞板加新鲜培养液的参数条件。
           Dispense Task Parameters程序设置中Volume选择50 μl，即移液头往细胞板里加液体积，Well selection选择与吸取培养液列数相一致的列数进行加液。同吸液参数设置类似，影响加液效果关键参数主要也包括：1. Liquid class 2. Distance from well bottom（图3）。
   
   
   图3. Bravo操作软件中加液Task Parameters显示图
   
           其中Dispense Liquid class参数中主要包含Dispense Parameters设置（图4）。在此次实验中，主要调节图中Dispense Parameters中的Velocity和Acceleration数值，调节条件见下表二，根据调节不同的参数设置，观察细胞贴壁情况。
   
   
   图4. Bravo操作软件中Dispense Parameters显示图
   
   表2. Dispense Liquid Class参数设置
   

   	①	②	③	④	⑤	⑥
   Velocity(0.1-500 μl/s)	1	2	5	10	15	50
   Acceleration(1-1,000 μl/s2)	1	2	5	10	15	50

   
           参数设置思路同吸液参数设置思路。即先选定表2中Dispense Parameters最低速度和最低加速度（见表2条件①，也即Velocity: 1 μl/s，Acceleration: 1 μl/s2），然后调节Distance from well bottom，由0.5、1、1.5、2、2.5和3 mm依次变化，观察细胞贴壁情况。根据实验结果和需求，确定合适的Distance from well bottom，根据此高度，变化不同的Dispense Parameters参数设置（如表二，①②③④⑤⑥6种条件），观察细胞贴壁情况、考虑实验所需时间和可重复性，选择合适的Dispense Parameters和Distance from well bottom参数设置。
   2.5

   Bravo程序设置好后，仪器准备运行。Bravo程序设置好后，仪器准备运行。
   
3. Ensight仪器成像
           Bravo仪器运行结束后，将细胞板离心，129 × g，1 min，之后使用Ensight仪器成像。
   

结果与分析

        使用Bravo自动化液体处理平台进行细胞换液包括两个步骤：1.从细胞板里吸培养液，2.往细胞板里加新鲜培养液。
        对于吸液条件来说，当固定Aspirate Parameters条件，选择表1条件①，移液头在距细胞板底0.5、1和1.5 mm位置处，细胞均易被吸起，而在2 mm及以上位置处，细胞不易被吸起（图5），所以吸液参数Distance from well bottom可选择2 mm。


图5. 设定细胞板内吸液Aspirate Parameters参数不变，变化Distance from well bottom进行吸液后孔内细胞状态图

        当固定吸液参数Distance from well bottom为2 mm，依次变化Aspirate Parameters中速度和加速度，调节条件依次是表1条件①-⑥，发现当固定高度在2 mm处后，变化Aspirate Parameters条件①-⑥对细胞状态影响较小，均未将细胞吸起（图6）。


图6. 设定从细胞板内吸液Distance from well bottom为2 mm，变化Aspirate Parameters参数进行吸液后孔内细胞状态图

        考虑吸液时间及细胞状态等综合因素，吸液中设置Distance from well bottom为2 mm，Aspirate Parameters是表1中条件③，也即Velocity: 10 μl /s，Acceleration: 10 μl/s2。
        固定好吸液条件后，随即选择Dispense Parameters表2条件中最低速度和加速度（见表2条件①，Velocity: 1 μl/s，Acceleration: 1 μl/s2），变化加液的Distance from well bottom的参数设置。我们发现，在移液头距细胞板底1 mm及以上处没有细胞脱落（图7）。根据实验稳靠性考虑，加液参数Distance from well bottom设置成2 mm。


图7. 固定从细胞板内吸液Aspirate Parameters和Distance from well bottom，往细胞板里加液Dispense Parameters参数也不变，变化加液中Distance from well bottom进行加液后孔内细胞状态图

        然后我们选择加液参数Distance from well bottom为2 mm，变化Dispense Parameters条件，设置从如表1条件①-⑥依次变化，调节至条件⑥（Velocity: 50 μl/s，Acceleration: 50 μl/s2），细胞会被吹起（图8），我们根据细胞状态及实验使用时间等因素考虑，Dispense Parameters选择表2条件③（Velocity: 10 μl/s，Acceleration: 10 μl/s2），Distance from well bottom选择2 mm。


图8. 固定从细胞板内吸液Aspirate Parameters和Distance from well bottom，往细胞板内加液中Distance from well bottom不变，变化加液中Dispense Parameters参数进行加液后孔内细胞状态图

        同时，我们还进行了对整块384孔细胞板进行吸液和加液的操作。如上所述，吸液条件：Distance from well bottom为2 mm，Aspirate Parameters是 Velocity: 10 μl/s，Acceleration: 10 μl/s2；加液条件：Distance from well bottom为2 mm，Dispense Parameters是 Velocity: 10 μl/s，Acceleration: 10 μl/s2。发现在这个条件下，整板293-T细胞也未被吸起。
        所以，我们使用Bravo自动化液体处理平台对293-T细胞板进行换液操作，293-T细胞可以贴壁不脱落。
        由本次实验可知，适当调节好从细胞板里吸液和往细胞板里加液的三个参数（1. Aspirate Parameters，2. Dispense Parameters，3. Distance from well bottom），是可以实现贴壁不牢细胞的换液操作的。
       需要注意的是，根据前期实验摸索得到临界参数条件时，Distance from well bottom设置高度适当提高一些，Aspirate Parameters和Dispense Parameters中速度和加速度适当降低一些，这样可以保证实验的重复性。
        另外，在吸液条件中，Distance from well bottom设置高度不同，细胞板内培养液剩余体积会不同，随移液头距细胞板底高度的提高，培养液剩余体积逐渐增多。如果实验者希望原始培液干扰实验影响降至最低，可以参照文中叙述距底高度条件，根据自身细胞特点，选择合适的距底高度，然后通过重复吸液加液操作，将原始培养液逐渐稀释，以此达到实验要求。

致谢

感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台的每位成员的帮助。

参考文献

1. Masters, J. R. and Stacey, G. N. (2007). Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc 2(9): 2276-2284.
2. 徐兰 和 刘敏英 (2009). 293T细胞的培养. 细胞生物学杂志(01): 130-130.