新生大鼠原代心肌细胞肥大模型的高内涵筛选应用
High-content Screening in Neonatal Rat Ventricular Myocytes (NRVMs) Hypertrophy Model   

材料与试剂

一、实验动物
新生SD (Sprague Dawley, SD) 大鼠，出生0-3天，购于浙江省医学科学院。

二、实验材料

1. 高糖DMEM培养基 (Corning，美国，catalog number: 10-013-CV)
2. 胎牛血清 (FBS) (Corning，美国，catalog number: 35-081-CV)
3. PBS (江苏凯基生物技术股份有限公司，catalog number: KGB5001)
4. 双抗青链霉素（sp） (Corning，美国，catalog number: 25-053-CI)
5. 去氧肾上腺素 (PE) (上海阿拉丁生化科技股份有限公司，catalog number: P106007-10g)
6. 新生鼠心脏组织解离试剂盒 (Miltenyi，德国，catalog number: 130-098-373)
7. 红细胞裂解液(Miltenyi，德国，catalog number: 130-094-183)
8. 70 μm细胞筛网 (浙江硕华生命科学研究股份有限公司，catalog number: 251200)
9. 0.22 μm真空滤网 (Millipore，美国，catalog number: SLGPR33RB)
10. 96孔黑板 (Corning，美国，catalog number: #3904)
11. BRDU (5-溴-2′-脱氧尿苷,溴脲嘧啶苷) (上海阿拉丁生化科技股份有限公司，catalog number: B5002)
12. Alexa Four 488 Phalloidin (Cell Signaling Technology，美国，catalog number: 8878S)
13. Hoechst 33342 (Cell Signaling Technology，美国，catalog number: #4082)
14. 4%多聚甲醛 (生工生物工程(上海)股份有限公司，catalog number: E672002-0500)
15. cTnT兔抗 (proteintech，catalog number: 15513-1-AP)
16. 免疫染色一抗稀释液 (碧云天，catalog number: P0103)
17. TRITC山羊抗兔 (proteintech，catalog number: SA00007-2)

仪器设备

1. 恒温振荡器 (Eppendorf，美国，model: ThermoMixer C)
2. 高速冷冻离心机 (Eppendorf，德国，model: Centrifuge 5810R)
3. Pico个人型高内涵成像分析系统 (Molecular Devices，美国，model: ImageXpress®)
4. 超净台 (Thermo，美国，model: 1300SERIES A2)
5. CO₂细胞培养箱 (Thermo，美国，model: Forma311)
   

实验步骤

一、新生大鼠心肌细胞的分离与培养

1. 乳鼠酒精消毒—开胸—取心脏放在装有含sp的PBS培养皿中——重复清洗2次到3次，剪去血管和心房，留取心室转移至空皿中
2. 剪碎心脏组织至1 mm3，加入少许预冷的PBS冲洗用吸管转移心脏碎片至50 ml管，静置2 min后吸去PBS，加入混合后的消化液，放进37 °C恒温振荡器，400 x g，15 min x 3次，每次间隙用无菌吸管吹打60余次。
3. 加入15 ml中和液（见溶液配方）终止消化，混匀后通过滤网 (70 mm) 过滤，并用3 ml中和液冲洗滤网.
4. 600 x g，4 °C，离心5 min，弃上清；加入10 ml 1x的红细胞裂解液重悬，静置2 min，再次600 x g，4 °C，离心5 min，弃上清；加入10 ml含Enzyme A的PBS重悬后用再次600 x g，4 °C，离心5 min，弃上清。
5. 加入60 ml高糖DMEM完全培养液重悬细胞，接种于75 cm²培养瓶内 (每10只乳鼠1瓶)，差速贴壁30 min。
6. 差速贴壁结束后收集所有培养瓶内的上清液至50 ml离心管内，600 x g，4 °C，离心5 min，弃上清，所得沉淀即为心肌细胞，加入含0.1% Brdu的高糖完全培养液重悬细胞，计数，将细胞按照5,000个/孔种入96孔黑板，培养48 h。

1. 取出培养3天的细胞，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3遍。
2. 0.2% Triton X-100孵育10 min，PBS洗3遍。
3. 含2% BSA的PBS封闭1 h。吸去封闭液，加入用免疫染色一抗稀释液以1:100比例稀释的cTnT抗体，4 °C摇床孵育过夜。其后，PBS清洗3遍，每次5 min。
4. 加入用2% BSA以1:100比例稀释的TRITC山羊抗兔二抗，室温避光孵育1 h。PBS清洗3遍，每次5 min。
5. 1 μg/ml Hoechst避光染色10 min以标记细胞核，PBS洗3遍。

1. 原代心肌细胞培养48 h后，换液加入含0.1% Brdu (0.1 mmol/l)的高糖基础培养基，饥饿24 h。
2. 实验分为对照组和模型组和给药组。对照组加入含0.1% Brdu (5-溴脱氧尿嘧啶核苷) 的高糖基础培养基 (100 µl)，模型组加入含100 mM的去氧肾上腺素 (PE) 和0.1% Brdu的高糖基础培养基100 µl，给药组相较于模型组再加入相应的药物浓度，孵育48 h。

1. 造模48 h后，取出铺有原代心肌细胞的96孔板，吸去培养液，PBS漂洗3遍，5 min/次。每孔加入500 µl多聚甲醛固定20 min。
2. 吸去多聚甲醛，PBS漂洗3遍，5 min/次。每孔加入0.1% Triton X-100透化10 min，PBS漂洗3遍，5 min/次。
3. 避光室温条件下，每孔加入100 µl Alexa Fluor 488 Phalloidin (鬼笔环肽) 染色10 min，吸净后每孔加入100 µl Hochest(1 μg/mL)染色10 min，吸净后PBS漂洗3遍，10 min/次。
4. 每孔加入适量PBS保持细胞湿润，避光4 °C保存，待用。

将96孔板底用擦镜纸拭后，置于高内涵成像分析设备进行荧光成像及分析，利用20x物镜加绿色，蓝色成像通道，选择空白孔，阳性药孔，调整曝光时间、激发光强度进行实验拍摄；

结果与分析

一、结果

1. 心肌细胞纯度鉴定结果
   采用免疫荧光方法标记心肌细胞纯度，结果如图1所示。
   
   
   图1.cTNT抗体标记的NRVMs细胞
   （说明：显微镜随机取6个不同的视野，cTnT阳性且cTnT呈平行细丝状的细胞为心肌细胞，除以Hoechst阳性的总细胞数，计算出心肌细胞纯度为(80.06±3.61)%。）
   
   
2. 荧光标记的心肌细胞肥大模型
   采用上述方法检测正常心肌细胞、PE诱导心肌细胞及诱导后药物干预心肌细胞，所获得的高内涵成像图像如图2所示。
   
   
   图2. PE处理的NRVMs细胞
   
   
   

1. 打开ImageXpress® Analysis system, 选中本次实验结果，点击右侧第一个按钮选择相应的双通道分析方法，操作界面如图3所示。
   
   
   图3. 分析结果初始界面
   
   
2. 设置细胞核蓝色通道参数，使软件分析准确识别到细胞核，操作界面如图4所示。
   
   
   图4. 细胞核染色通道
   
   
3. 确定F-actin染色的细胞面积的分析范围，调整Segmentation Parameters，操作界面如图5所示。
   
   
   图5. 软件识别F-actin 染色通道
   
   
4. 确定好参数以后开始运行分析系统，操作界面如图6所示。
   
   
   图6. 分析参数及命名
   
   解析：可以看出，经PE (100 μM) 造模48小时以后，细胞面积增大了约1.6倍，该结果表明心肌肥大模型诱导成功。统计结果一般以Control组的三复孔面积平均数为基准进行标准化处理，每组至少3复孔，组间数据采用方差分析 (one-way ANOVA)进行统计。
   
   
5. 高内涵统计数据分析结果。
   采用高内涵分析系统对获得的心肌细胞代表性图片进行分析，得到的分析结果如表1所示。
   
   表1. 高内涵统计数据分析结果
   

   	细胞核个数	阳性细胞*平均面积	相对平均面积(%)
   Control	939	918.579	91.17771
   	1142	910.621	90.38781
   	897	1193.18	118.4345
   PE (100 μM)	1267	1550.35	153.887
   	822	1627.15	161.5101
   	903	1685.38	167.29
   PE(100 μM)+Drug	1077	996.811	98.94299
   	716	797.142	79.12394
   	991	1082.93	107.4911

   
   注：阳性细胞*：即同时识别到细胞核和细胞质的细胞.
   
   
   

失败经验

1. 对心肌细胞进行饥饿处理前，应使用PBS把残余的血清清洗干净，血清的存在可能会干扰细胞状态从而使心肌细胞肥大模型诱导失败。

溶液配方

1. 含1%双抗 (sp) 的PBS：
   250 ml PBS + 2.5 ml双抗混匀备用 (用于洗心脏—预冷)
2. 完全培养液：
   90%高糖/低糖DMEM + 10% FBS + 1% sp
3. 消化液：
   (试剂盒，每20只乳鼠的用量)
   
   表2. 消化液中不同消化酶配比
   

   Enzyme mix 1 (µl)		Enzyme mix 2 (µl)
   Enzyme P	Buffer X	Enzyme A	Enzyme D	Buffer Y
   125	4600	25	200	50

   
   
4. 中和液：
   20 ml 高糖DMEM + 5 ml FBS + 0.25 ml sp (80% + 20% + 1%) 
5. 裂解液：
   1x红细胞裂解液：1 ml 10x裂解液 (消化试剂盒) + 9 ml MiliQ水 (真空滤网过滤)
6. 裂解后重悬液：
   15 µl Enzyme A + 10 ml 含sp的PBS
   

致谢

感谢浙江大学药物信息学研究所-Molecular Devices高内涵成像联合实验室的设备支持。该项目受国家自然科学基金 (项目编号81822047) 的支持资助。

参考文献

1. Glembotski C. C. (2013). Classic studies of cultured cardiac myocyte hypertrophy: interview with a transformer.Circulation research 113(10): 1112–1116.
2. Guang H, Xin W, Zuo C.(2019). Prevalence of heart failure and left ventricular dysfunction in China: the China Hypertension Survey, 2012–2015. Eur J Heart Fail 21(11): 1329-1337.
3. Nakamura, M. and Sadoshima, J. (2018). Mechanisms of physiological and pathological cardiac hypertrophy. Nat Rev Cardiol 15(7): 387-407.
4. Prasad, A. M., Ma, H., Sumbilla, C., Lee, D. I., Klein, M. G., Inesi, G. (2007). Phenylephrine hypertrophy, Ca2+-ATPase (SERCA2), and Ca2+ signaling in neonatal rat cardiac myocytes. American journal of physiology. Cell physiology 292(6): C2269–C2275.