摘要:RANKL是成骨细胞与破骨细胞交流的关键因子,是治疗骨质疏松的重要靶点 (Koldkjaer Solling et al., 2016; Han et al., 2018)。我们前期工作发现RANKL通过蛋白酶体途径泛素化降解。泛素化涉及三个主要步骤:活化,结合和连接,分别由泛素激活酶 (E1),泛素结合酶 (E2s) 和泛素连接酶 (E3s) 执行,其中E3连接酶具有底物特异性 (Dikic et al., 2009)。为了找到RANKL泛素化降解相关的关键调控E3连接酶,我们利用化学生物学技术平台的Mouse siGenome全基因组siRNA文库中部分与泛素化E3连接酶相关的文库进行筛选。在成骨细胞系C3H10中构建稳定表达RANKL-GFP 融合蛋白的单克隆细胞株,在该细胞株中转染E3 ligase siRNA文库,通过GFP蛋白的荧光强度变化反映RANKL的表达水平,从而找到能够特异性调控RANKL降解的E3连接酶。
关键词: RANKL, 泛素化降解, E3连接酶, siRNA文库筛选
图1. 筛选流程示意图
材料与试剂
- 384孔板 (PerkinElmer, ViewPlate-384 F TC, catalog number: 6007460)
- Mouse siGenome全基因组siRNA文库之Ubiquitin Conjugation Subset化学生物学技术平台的整库筛选类siRNA文库购自Dharmacon品牌,以SMARTpool的形式保存于384孔板中,每条基因的对应孔位中同时含有4条不同序列的siRNAs (SMARTpool试剂),从而保证产生高效的基因沉默效果。我们使用其中与泛素化相关的亚文库:
Ubiquitin Conjugation Subset 1:包含针对小鼠Cullin、E1、E2、HECT E3 Ligases等79个基因的siRNA亚文库。
Ubiquitin Conjugation Subset 2:包含针对小鼠F-box和SOCS box E3 Ligases等102个基因的siRNA亚文库。
Ubiquitin Conjugation Subset 3:包含针对小鼠RING finger和RING finger-like E3 Ligases等330个基因的siRNA亚文库。 - Opti-MEM (Gibco, catalog number: 31985070)
- MEM Alpha Medium (Corning, catalog number: 10-022-CV)
- DPBS (Corning, catalog number: 21-031-CVR)
- Fetal Bovine Serum (Ausbian, catalog number: VS500T)
- penicillin streptomycin (Gibco, catalog number: 15140-122)
- 0.25% Trypsin-EDTA (Gibco, catalog number: 25200-072)
- GFP tag Mouse McAb (proteintech, catalog number: 66002-I-Ig)
- Rabbit Anti-Mouse HRP (Dako Denmark A/S, catalog number: P0260)
- Nonspecific Ctr Pool (Thermo Fisher, catalog number: D-001206-13-05)
- RNAiMAX Transfection Reagent (Thermo Fisher, catalog number: 13778150)
- DharmaFECT 1 Transfection Reagent (Thermo Fisher, catalog number: T-2001-02)
- DMSO (Sigma-Aldrich, catalog number: D2650)
- MG132 (Selleck, catalog number: S2619)
- Hoechst 33342 (Invitrogen, catalog number: H21492)
- 16% PFA (Alfa Aesar, catalog number: 30525-89-4)
仪器设备
- 干细胞多色流式细胞分选仪Aria III (BD, BD FACS Aria III)
- 干细胞多色流式检测仪cytoflex LX (Beckman, CytoFlex LX五激光)
- 全光谱激发共聚焦显微镜 Leica SP8 WLL (Leica, Leica TCS SP8 WLL)
- Ensight多功能微孔板检测仪 (PerkinElmer, Ensight)
- Multidrop自动分液器 (Thermo Fisher, Multidrop Combi)
- Elx405自动洗板机 (BioTek, ELx405)
- 台式高速大容量冷冻离心机 (Eppendorf, 5810R)
- CO2细胞培养箱 (Thermo Fisher, Series 8000 Direct-Heat CO2 Incubator, 184 L)
- Opera激光共聚焦高内涵细胞成像分析系统 (PerkinElmer, Opera LX488/561/640)
实验步骤
一、构建C3H10-RANKL-GFP单克隆细胞株
- 构建phage-RANKL-GFP融合表达质粒。
- 包装RANKL-GFP慢病毒,辅助质粒为VSVG,Δ8.9。
- 慢病毒感染C3H10细胞,48 h后流式分选GFP阳性的细胞至96孔板中,1 cell/孔,扩增后western blot / FACS / confocal鉴定RANKL-GFP的表达情况 (如图2所示),选择正确的单克隆株C3H10-RANKL-GFP-7扩增并冻存。
图2. C3H10-RANKL-GFP单克隆细胞株
二、筛选预实验
对筛选用的细胞密度,转染试剂类型,转染试剂用量等在384孔板中进行了预实验 (设计如图3所示)。转染72 h后用Ensight多功能微孔板检测仪进行检测,明场拍摄细胞形态与密度,488 nm荧光检测GFP。
经转染优化实验,确定最适转染条件为:在384孔板中,使用LipofectamineTM DharmaFECT1 0.1 μl/孔,细胞接种密度 1,000个/孔,以MG132 (终浓度10 μM) 作为阳性对照,每个siRNA文库做2个重复。
图3. 筛选预实验384孔板设计图
三、筛选正式实验
- 阴性对照siRNA的制备:
使用1x siRNA buffer 稀释Non-targeting siRNA至0.1 μM;将阴性对照siRNA按照如图4所示加入对应孔内,每孔10 μl。
图4. 筛选正式实验384孔板设计图
- 转染试剂的制备:
- 细胞悬液的制备:
- 收取细胞进行检测:
结果与分析
- 拍照得到多张如图5所示的384孔板照片。
图5. 筛选正式实验384孔板图像之一
- 两个重复的384孔板拟合度较好,实验结果可信度较高 (如图6)。
图6. 筛选正式实验384孔板两个重复的拟合度
- 对细胞质中的GFP荧光强度进行统计分析 (如图7),找出GFP荧光强度高于阳性对照的孔,对照文库信息找到相应的E3 ligase,构建表达质粒,进行下一步验证 (泛素化降解、相互作用、功能调控等)。
图7. 筛选正式实验384孔板绿色荧光强度统计分析
溶液配方
- α-MEM完全培养基
MEM Alpha基础培养基 + 10%胎牛血清 + 1%双抗
致谢
邹卫国实验室的该工作得到了中国科学院大学,生物化学与细胞生物学研究所,化学生物学技术平台的大力支持。
参考文献
- Dikic, I., Wakatsuki, S. and Walters, K. J. (2009). Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nat Rev Mol Cell Biol 10(10): 659-671.
- Han, Y., You, X., Xing, W., Zhang, Z. and Zou, W. (2018). Paracrine and endocrine actions of bone-the functions of secretory proteins from osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts. Bone Res 6: 16.
- Koldkjaer Solling, A. S., Harslof, T., Kaal, A., Rejnmark, L. and Langdahl, B. (2016). Hypercalcemia after discontinuation of long-term denosumab treatment. Osteoporos Int 27(7): 2383-2386.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王婧惠, 索金龙, 邹卫国. (2021). 调控RANKL降解的E3泛素连接酶的筛选. // 高通量筛选实验手册.
Bio-101: e1010860. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010860.
How to cite: Wang, J. H., Suo, J. L. and Zou, W. G. (2021). Screening of E3 Ubiquitin Ligase that Regulates RANKL Degradation. // High-throughput Screening Protocol eBook.
Bio-101: e1010860. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010860.