siRNA文库转染条件优化方法
Optimization of siRNA Library Transfection    

研究背景

理想的转染条件需要同时达到两方面要求：一是转染阳性率高，二是转染毒性低。影响siRNA转染效果的因素，包括转染方式、细胞接种数目、转染试剂的种类及用量、转染时间及siRNA浓度等。
转染方式 siRNA转染实验共涉及三个元素：细胞、siRNA和转染试剂。根据三个元素加入顺序的不同，转染方法分为顺式转染和反式转染两类 (Persengiev et al., 2004) (表1)。在反式转染的步骤中，先将siRNA加入多孔板中，然后加入转染试剂。转染复合物形成之后，加入细胞悬液。顺式转染则相反，先在孔中加入细胞，细胞贴壁后加入siRNA和转染试剂形成的转染复合物。对于高通量实验，反式转染是首选的转染方式，因为：1) 铺细胞和转染一步完成，自动化步骤简便，可实现更高通量；2) 不需要在一块单独的板上制备siRNA-转染试剂复合物再转移至细胞板内，节约了耗材成本；3) siRNA文库可提前制备好并储存在孔板中冰箱保存，筛选实验开展前溶解后可直接使用，文库制备和筛选实验开展的时间安排相对灵活。

表1. 顺式转染与反式转染


细胞接种数目 细胞接种数目的确定需要同时考虑两方面的因素：第一，研究者所关注的生物学表型对细胞密度的要求。例如，筛选细胞增殖的调控基因时，需尽量保证整个实验过程中细胞处于增殖状态，若过早达到接触抑制会导致丢失阳性基因，因此起始的细胞接种密度不可过高；而在利用划痕实验 (wound-healing) 鉴定细胞迁移调控因子的筛选实验中 (Wang et al., 2019)，需要保证划痕时细胞密度达到90%-100%，以排除细胞增殖对细胞迁移表型的影响。第二，不同细胞密度对转染试剂的耐受程度。转染试剂往往存在一定的细胞毒性，尤其在细胞密度过低时毒性更加显著。因此，在符合生物学表型对细胞密度要求的前提下，可尽量增加细胞接种数目，以降低转染毒性。
转染试剂 转染试剂的优化主要涉及转染试剂种类和用量。不同细胞类型适用的转染试剂种类不同。我们常用的siRNA转染试剂包括DharmaFECT及Lipofectamin RNAiMAX，均属于脂质体类转染试剂。每孔转染试剂的用量需要同时考虑转染效率、转染毒性及高通量筛选的成本。提高转染试剂的用量可以部分程度上提高转染效率，但同时会增加转染毒性及筛选成本。因此，需要综合考虑转染效率和转染毒性，在保证转染效率的情况下，选用尽可能低浓度的转染试剂。转染孔的细胞密度或细胞活力保持在无转染试剂对照孔的80%以上，一般被认为是转染毒性可接受的条件。
转染时间及siRNA浓度 我们利用Dharmacon公司的全基因组siRNA文库开展RNAi筛选时，siRNA的工作浓度一般选择20 nM，转染后48-96 h开展检测。转染时长的确定要同时考虑siRNA下调靶基因mRNA水平到靶基因蛋白水平实现下调的时间，以及所检测表型对时长的要求。若筛选体系有已知的阳性基因，可根据阳性基因siRNA出现表型的时长确定筛选体系的时长。
反式转染是高通量siRNA筛选的主要转染方式，下文重点介绍反式转染的条件优化方法。若反式转染效率不高的细胞，可开展顺式转染条件的优化，需要优化的因素及孔位排布设计与反式转染类似。
优化转染条件我们一般使用转染指示剂TOX，该siRNA进入绝大多数种类的细胞后会导致细胞死亡。若所用细胞对TOX不敏感，可选用带荧光的siRNA，通过观察进入细胞内的siRNA的荧光强度来判断转染效率。下文以TOX作为转染指示剂为例介绍反式转染优化方法。

材料与试剂

1. 96孔U底板 (Costar, catalog number: 3879)
2. 384孔黑边底透平底板 (Corning, catalog number: 3764)
3. Hela细胞 (中国科学院细胞库/干细胞库，catalog number: TCHu187)
4. ON-Target Plus^TM Non-targeting control pool (Dharmacon, catalog number: D-001810-10-05)
5. TOX transfection control (Dharmacon, catalog number: D-001500-01-05)
6. 5x siRNA buffer (Dharmacon, catalog number: B-002000-UB-100)
7. Lipofectamin RNAiMax (ThermoFisher Scientific, catalog number: 13778150)
8. DharmaFECT 1 Transfection Reagent (Dharmacon, catalog number: T-2001-04)
9. OptiMEM (Invitrogen, catalog number: 31985070)
10. DPBS (Gibco, catalog number: 2122736)
11. DMEM高糖培养基 (Hyclone, catalog number: SH30243.01)
12. Trypsin-EDTA (Gibco, catalog number: 2120539)
13. Propidium Iodide (Invitrogen, catalog number: P3566)
14. Hoechst 33342 (Invitrogen, catalog number: H3570)
15. CellTiter Glo Viability Assay (Promega, catalog number: G7573)
    

仪器设备

1. CO₂细胞培养箱 (Thermo Fisher, model: SERIES 8000 DH)
2. 自动分液器 (Thermo Fisher, model: Multidrop Combi)
3. 多模式微孔板检测仪 (PerkinElmer, model: Ensight)
4. 多功能酶标仪 (PerkinElmer, model: Envision)
5. 低温水平离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge 5810R)
6. 细胞计数仪 (BodBoge, model: JYS-SC-021H)
   

实验步骤

1. 稀释siRNA
   将阴性对照siRNA (ON-Target Plus^TM Non-targeting control pool, NC) 及阳性对照TOX transfection control (储液浓度均为20 μM) 使用1x siRNA buffer按1:200比例稀释至100 nM。
   
2. 在384孔板内加入相应siRNA
   将步骤1稀释好的siRNA试剂按照图1的排布情况分别加入多孔板相应位置，每孔10 μl。
   注：我们一般使用8通道排枪进行加样，可使用96孔U底板作为试剂加样中转板。由于384孔板中复孔设计在上下相邻孔位，我们使用8通道排枪加样两次完成384孔板中一整列的加样操作，具体加样操作可参见视频1。中转板试剂排布情况见图2。图2的排布情况是依据图1中孔板的孔位设计而定的，如果图1实验条件改变，图2相应孔位随之改变。
   
   
   
   视频1.siRNA转染试剂转移加样操作视频
   
   
3. 在384孔板内加入转染试剂
   使用OptiMEM稀释转染试剂 (本文使用RNAiMax和DharmaFECT 1)，稀释比例 (转染试剂/ OptiMEM) 分别为0.05 μl/10 μl，0.075 μl/10 μl，0.1 μl/10 μl，通过上下颠倒EP管或手轻弹EP管外壁轻柔混匀，混匀后按照图1排布方式加入多孔板的相应位置，每孔加入10 μl。
   注：如果使用8通道排枪操作，可以参考图2将转染试剂加至96孔板相应位置，方法同步骤2。
   
4. 130 × g，离心1 min，室温孵育20 min。
   注：离心作用主要是混匀siRNA及转染试剂；室温孵育过程中可开展后续细胞悬液制备的步骤。
   
5. 细胞悬液制备
   在超净工作台中，消化Hela细胞，重悬后进行细胞计数。在50 ml离心管中配制最高细胞密度的悬液 (本实验为1500个/30 μl)，并将此悬液按不同比例进行稀释，重悬及稀释所用的试剂为含有10% 胎牛血清的DMEM培养基。最终得到500个/30 μl，750个/30 μl，1000个/30 μl的细胞悬液。
   注：不同细胞系接种细胞数目不同，细胞数梯度可根据实际情况进行设置。另外，使用Multidrop加细胞悬液有一定量的死体积 (充满管道所需体积)，配制细胞悬液时需要将死体积考虑进去。
   
6. 将细胞悬液加入384孔板内
   使用Multidrop自动分液器将各浓度的细胞悬液加至384多孔板的相应位置 (图1)，每孔加入30 μl。
   注：依次按照细胞密度从低到高的顺序加，中间不需另外冲洗管道。另外，实验孔的周边两列孔内加入PBS等液体，可减少由实验孔的蒸发导致的边缘效应。
   
7. 将384孔实验板放入细胞培养箱培养。
   
8. 检测
   转染后24 h、48 h和72 h时间点观察每个样品孔的细胞融合度及细胞死亡情况。
   
   
   图1. 在384孔板开展siRNA转染条件优化的排板布局
   
   
   图2. 96孔加样中转板的排板布局
   
   

结果与分析

1. 转染毒性分析
   分别在siRNA转染24 h、48 h、72 h用Ensight仪器进行成像拍照，其中72 h各个实验条件成像结果如图3所示。图3A为未转染组细胞的生长情况，与转染NC组 (图3B) 相比可以看出转染试剂RNAiMax与DharmaFECT 1对Hela细胞没有表现出明显的转染毒性。
   
2. 转染效率分析
   RNAiMax转染组与DharmaFECT 1转染组中，转染TOX siRNA与NC siRNA组相比，细胞均出现明显的细胞死亡 (图3B)，其中RNAiMax 0.075 μl/孔及DharmaFECT 1 0.1 μl/孔具有最佳转染效果。
   细胞密度的确定可根据筛选检测指标对细胞密度的要求来确定。
   注：一般情况下，我们根据明场成像即可判断最佳的转染条件，如果需要通过定量检测确定最优转染条件，可在72 h明场成像结束后，利用CellTiter-Glo对细胞活力进行检测，从数值上判断最优转染条件。
   
   
   图3. 不同转染条件转染72 h细胞明场成像图 A. 未转染组不同细胞接种数的生长 情况；B. 不同转染条件下细胞的生长情况。
   
   

致谢

感谢中科院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台全体成员的建议和帮助。本工作得到中科院关键技术人才项目 (Y907S21A11) 的资助。

参考文献

1. Persengiev, S. P., Zhu, X. and Green, M. R. (2004). Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs). RNA 10: 12-18.
2. Wang, X., Liu, R., Zhu, W., Chu, H., Yu, H., Wei, P., Wu, X., Zhu, H., Gao, H., Liang, J., Li, G. and Yang, W. (2019). UDP-glucose accelerates SNAI1 mRNA decay and impairs lung cancer metastasis. Nature 571: 127-131.