摘要:报告基因实验通过将报告基因的cDNA序列融合于特定启动子调控序列或目的基因之后,稳定或瞬时转染到哺乳动物细胞中,使目标基因的表达调控成为可能。该方法的主要优点是灵敏、可靠、操作方便、动态范围广、适应于高通量筛选,在药物研发过程中广泛应用于对靶点的研究。本文介绍了利用报告基因系统高通量筛选酶活小分子抑制剂的实验方法。本文选取一种在正常组织中相对低表达或不表达,但在多种恶性肿瘤中高表达的羟化酶。已知该羟化酶能够通过调控Notch信号通路来发挥促癌功能(Platonova et al., 2017)。因此,我们通过构建Notch信号通路驱动的GFP报告基因系统,高通量筛选能够抑制羟化酶活性或调控羟化酶表达的小分子化合物。筛选过程分为单浓度单点单细胞系的大规模初筛和在三株肿瘤细胞中的IC50测定两部分。初筛将三质粒瞬时共转染HEK293T细胞,Incucyte仪器能够长时间记录加入小分子化合物后细胞中GFP荧光强度的变化,进而分析比较一万多种小分子化合物对羟化酶激活Notch信号通路的抑制作用。经重复验证,初筛阳性率约2%。进而,将初筛得到的阳性Hits在三株羟化酶高表达的肿瘤细胞以及HEK293T细胞中进行IC50测定。通过IC50值的比较,挑选出能够特异性抑制羟化酶高表达的肿瘤细胞增殖而对HEK293T细胞增殖无显著影响的化合物,为靶向羟化酶和Notch信号通路治疗肿瘤的研究提供候选小分子药物。
关键词: 高通量, 报告基因筛选系统, 酶活抑制剂, 小分子化合物
图1. 筛选实验总流程.
材料与试剂
- 96孔板 (Costar, catalog number:3879)
- 384孔板 (Corning, catalog number:3764)
- 384-Roche plate (TTP)
- ABgene 384-0781 (ABgene)
- CountessTM 细胞计数腔室载玻片 (Thermofisher, catalog number:C10228)
- DMEM培养基 (HyClone)
- Opti-MEM (Gibco)
- 0.25% Trypsin (Invitrogen)
- FugeneHD (Promega)
- DMSO (sigma)
- CellTiter-Glo (Promega)
- 化合物 (由中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台提供)
- DMEM完全培养基(见溶液配方)
仪器设备
- Multidrop自动分液器 (Thermofisher,model number:Multidrop Combi)
- Bravo自动化液体处理平台(Agilent,model number:Bravo)
- 离心机 (Eppendorf,model number:5810R)
- Incucyte活细胞长时间动态影像成像分析仪 (Essen BioScience, model number:Incucyte FLR)
- Mosquito (Labtech TTP)
- 细胞计数仪(BodBoge, model number:JSY-SC-022)
- 多标记微孔板检测仪(PerkinElmer,model number:Envision)
实验步骤
一、报告基因系统单浓度筛选酶活抑制剂
通过将GFP报告基因质粒、Notch基因表达质粒和羟化酶表达质粒瞬时共转染HEK293T细胞,待基因表达后加入待测小分子化合物,并利用Incucyte仪器长时间记录细胞中GFP荧光强度变化,以获取Notch信号通路驱动的GFP表达情况,间接反应小分子化合物对羟化酶介导的Notch信号通路活化的抑制效果,筛选有效Hits。当小分子化合物抑制羟化酶后,Notch蛋白被切割产生活化转录因子的效率下降,由该转录因子驱动的GFP报告基因表达则同时减弱;当小分子化合物对羟化酶无抑制作用时,Notch蛋白可以在蛋白酶的帮助下顺利产生大量活性转录因子,从而驱动GFP表达。本实验中初筛设置为384孔板单孔单浓度的筛选模式,得到初步阳性化合物之后将这些化合物进行一次2复孔单浓度的重复实验,以确认筛选结果。
- 细胞的转染
本次实验中羟化酶表达质粒,Notch表达质粒和GFP报告基因表达质粒三种质粒的转染总量为90 ng,比例为39:39:12;质粒总量 (ng) 和转染试剂 (nl) 的比例是1:3。具体的转染条件需根据课题不同进行体系优化及验证后确认。 - 细胞药物处理
绝大部分化合物溶解在100% DMSO中,储存浓度为10 mM,以96孔板 (Costar.3879) 模式保存在-80 °C冰箱。室温平铺解冻,注意避光。解冻后离心129 × g,2 min。384孔板细胞反应体系中化合物的终浓度为10 μM,所以总共需要稀释1000倍,稀释过程分两步完成。 - 信号检测
加入化合物后将384孔细胞板放进Incucyte仪器中每6 h拍照一次,收集在化合物处理下细胞产生的GFP荧光信号。Incucyte仪器设置参数如图2。
图2.Incucyte仪器设置参数.
Tray Type:选择载体类型,如微孔板、载玻片
Vessel Type:选择孔板类型
Scan Type:选择拍照参数类型,如fluorescence&Phase contrast
Scan Pattern:选择微孔板需拍照的范围
Set Timeline Scan Intervals:选择拍照开始时间以及间隔时间
设置好各参数一定点击Apply进行确认并开始。 - 重复实验
根据抑制率的计算,划定50%的阈值,将得到的初步阳性结果中所有化合物汇集在新的96孔板中,按照2复孔的模式重复一次上述实验进行结果验证,剔除假阳性化合物。
二、初筛Hits抑制细胞增殖的IC50值测定
通过初筛鉴定出了能够抑制羟化酶激活Notch的阳性Hits,在该酶高表达的3株肿瘤细胞和HEK293T中设置一系列浓度梯度进行IC50 值的测定。每个化合物设置10个浓度,最高浓度为40 μM,2倍稀释。
- 制作细胞接种密度的标准曲线
- 接种细胞
- 细胞药物处理
- 信号检测
- IC50曲线拟合
利用GraphPad Prism软件进行四参数的曲线拟合,得到IC50值。
注意事项
- 多质粒转染系统需要在预实验阶段优化转染条件,例如质粒之间摩尔比,每孔转染质粒总量,转染混合物体积与细胞培液体积比等。
- 转染前384孔板中接种的细胞密度应根据细胞转染效率进行优化选择。
- 利用CellTiter-Glo试剂进行细胞增殖实验前,要仔细判断合适的细胞接种密度,需要考虑因素如下:通过制作标准曲线来确认试剂对不同细胞株,在每个孔细胞数目的线性检测上限;同时观察比较细胞生长速度和细胞大小;还要考虑化合物处理时微孔板中细胞覆盖度应为30-50%。
- 进行转染操作的细胞传代次数 (≤ 10) 应尽量少,同时注意培养时细胞不能长得过满,否则影响转染效率。
- 转染时细胞培养液中不含抗生素,否则影响转染效率。
- 化合物一般以10 mM储存在100% DMSO中,从DMSO相到水相的稀释比例不低于1:100,以保证化合物的充分溶解。
- 细胞水平荧光信号的检测,优先选择黑色板进行实验,底部透明有利于观察细胞状态。
结果与分析
IncuCyte拍照的结果应用IncuCyte 2011A软件进行分析:
分析参数的设置如图3。
图3. Incucyte仪器分析参数的设置.
软件分析结束后,将Confluence和object summed intensity per mm2两个参数以384孔板排列的方式导出。
每孔的平均荧光强度
将所有对照孔的平均荧光强度求平均数,记为Xcontrol。
每个化合物的荧光抑制率
设定某阈值如抑制率大于50%作为阳性化合物的标准,则通过计算每个化合物的荧光抑制率,即可挑选出阳性化合物分子。
溶液配方
- DMEM完全培养基:DMEM高糖培养基 + 10%胎牛血清
致谢
感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台的支持。
参考文献
- Platonova, N., Parravicini, C., Sensi, C., Paoli, A., Colombo, M., Neri, A. and Eberini, I. (2017). Identification of small molecules uncoupling the Notch::Jagged interaction through an integrated high-throughput screening. PLoS one 12(11): e0182640.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:陈晓慧, 邹怡然, 兰姝珏, 王海波. (2021). 报告基因系统高通量筛选酶蛋白的小分子抑制剂. // 高通量筛选实验手册.
Bio-101: e1010866. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010866.
How to cite: Chen, X. H., Zou, Y. R., Lan, S. J. and Wang, H. B. (2021). High-throughput Screening Small Molecule Inhibitors of Enzyme by Reporter Gene System . // High-throughput Screening Protocol eBook.
Bio-101: e1010866. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010866.