EU标记法测定细胞RNA合成
EU Labelling Method for RNA Synthesis Detection of Cells   

材料与试剂

1. 96孔黑边底透板 (Corning, catalog number: 3904)
2. HeLa细胞
3. 胎牛血清 (Gemini, catalog number: 900-108 ) 
4. Global RNA Synthesis Assay kit (Abcam, catalog number: ab273285)
   试剂盒内提供的试剂：
   Wash Buffer (10x)
   Fixative Solution
   Permeabilization Buffer (10x)
   RNA Label (100x)
   Copper Reagent (100x)
   Fluorescent Azide (100x)
   Reducing Agent (20x)
   Total DNA Stain (1000x)
   Actinomycin D (100x)
5. DMEM培养基 (Hyclone, catalog number: SH3002201)
6. PBS (见溶液配方)
   

仪器设备

1. 高内涵细胞分析仪 (PerkinElmer, Opera，配有355 nm/488 nm/561 nm激光器)

实验步骤

1. 将待检测HeLa细胞提前48 h铺到96孔板内，每孔铺入细胞10,000个，每孔培 养基100 μl。
2. 提前1-24 h加入RNA label试剂1 μl (根据实验目的，细胞类型调整孵育时间)； 在加入RNA label试剂前2 h加入Actinomycin D。
3. 提前准备好1x Wash Buffer，1x Permeabilization Buffer：用灭菌水 (去离子水) 稀释10x Wash Buffer，10x Permeabilization Buffer。
4. 去除培养基，加入100 μl PBS清洗一遍，去除PBS。
5. 加入Fixation Buffer 100 μl，避光室温固定15 min，去除Fixation Buffer。
6. 连接反应液配方：
   PBS                                               93 μl
   Copper Reagent (100x)              1 μl
   Fluorescent Azide (100x)           1 μl
   Reducing Agent (20x)                 5 μl
   每孔加入提前准备好的连接反应液100 μl，避光室温孵育30 min。
7. 再加入100 μl 含有Total DNA Stain的Wash Buffer，避光室温孵育5 min，去除 Wash Buffer。
8. 去除连接反应液，加入1x Wash Buffer 100 μl，清洗3次。
9. 加入100 μl Wash Buffer，用opera高内涵细胞分析仪拍照分析细胞RNA合成情 况。
   

结果与分析

1. 图像拍摄：
   分别使用Opera的355/488 nm激光器激发对应细胞核DNA蓝色荧光，以及新生成RNA的绿色荧光信号，使用20倍物镜拍摄，见图1。
   
   
   图1. Opera拍摄结果示例图 左上图：提前12 h加入RNA label后，opera拍摄的细胞内绿色荧光标记新合成的RNA；右上图：提前加入Actinomycin D后，视野内细胞几乎无绿色荧光：下图：为DNA染料染色后拍摄到细胞核
   
   
2. 图像分析：
   1)

   根据细胞核信号的强度和面积设定条件遴选出视野中所有符合标准的细胞核以及整个细胞区域，见图2步骤1-4。
   2)

   在选择出的细胞群体中，分别计算每个细胞的细胞核区域及完整细胞区域内绿色荧光信号值 (Mean为单位像素点的平均荧光强度值；Sum为每个细胞区域内荧光强度的总值)，见图2步骤5-7。
   
   
   图2. 图像数据处理流程
   
   
   3)

   计算孔内细胞平均新RNA的合成 (采用的数据为细胞核区域内荧光强度的总值)，见图3。
   
   
   图3. RNA合成水平统计图 在HeLa细胞中加入1 ng/ml浓度的Actinomycin D处理48 h之后，利用EU标记法测定细胞内总RNA合成。
   
   
   

注意事项

1. 试剂盒内提供的Actinomycin D浓度较高，较长时间的处理可能会导致细胞死亡 以及脱落，可以降低浓度使用。
2. 本方法RNA标记荧光染料的激发光波长为494 nm，发射光波长为521 nm。
3. 背景对照组设置：不加入RNA label孵育，需要加入连接反应液孵育，后续操作 与其他实验孔相同。
4. 一般是采用细胞核或完整细胞区域荧光强度的总值去计算RNA，因为不同的细胞形态细胞面积可能相差较大，所以用总值计算更为合理。
5. 新合成的RNA主要集中在细胞核内，部分细胞的胞浆部分荧光强度过低，与背景相差不大，此时采用细胞核区域荧光强度的总值指征RNA合成更为合适。
   

溶液配方

1. PBS
   1.06 mM                     KH₂PO₄                           0.144 g/L
   155.17 mM                 NaCl                                 9 g/L
   2.97 mM                     Na₂HPO₄-12H₂O           1.064 g/L
   

致谢

本项目得到中科院生化与细胞所基金的支持。感谢中科院生化与细胞所化学生物学技术平台在高内涵成像分析实验中给予的帮助。

参考文献

1. Jao, C. Y. and Salic, A. (2008). Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 15779-15784.