抗菌活性化合物高通量筛选方法
High Throughput Screening Method for Antibacterial Compounds   

图文摘要




图1. 抗菌活性化合物高通量筛选流程 阳性指示：如阳性对照孔中类似，孔内微生物生长受到有效的抑制，液体澄清；阴性指示：如阴性对照孔中类似，孔内微生物生长迅速，无明显抑制。

材料与试剂

一、耗材

1. 100 μl枪头 (赛多利斯公司)
2. 200 μl枪头 (赛多利斯公司)
3. 1000 μl枪头 (赛多利斯公司)
4. 96孔板 (Thermo Scientific公司)

1. 大肠杆菌 (ATCC 25922)
2. 金黄色葡萄球菌 (ATCC 27217)
3. 溶藻性弧菌 (ATCC 33787)
4. 嗜水气单胞菌 (ATCC 35654)
5. 耐万古霉素肠球菌 (VRE)
6. 耐甲氧西林金葡菌 (MRSA)
7. 耐多药肺炎链球菌 (MDRSP)
   菌株由海军军医大学生物化学与分子生物学教研室传代保存。

1. 二甲基亚砜 (DMSO) (上海博光生物科技有限公司)
2. 氯霉素 (上海金穗生物科技有限公司) 
3. 氧氟沙星 (北京索莱宝科技有限公司)
4. 氟哌酸 (北京索莱宝科技有限公司)
5. 氨卞西林 (上海博光生物科技有限公司)
6. 万古霉素 (北京索莱宝科技有限公司)
7. 头孢噻肟 (北京索莱宝科技有限公司)

1. 营养肉汤培养基（NB）
2. 脑心浸液肉汤 (BHI)
3. AHM (Aeromonas Hydrophila Medium) 鉴别培养基
4. 耐万古霉素肠球菌鉴定培养基(VRE)
5. 甘露醇盐琼脂 (MSA)
6. 含0.5%酵母浸出液的Todd-Hewitt培养基 (THY)

仪器设备

1. 移液器 (Eppendorf公司)
2. 立式压力蒸汽式灭菌锅 (上海博迅实业有限公司医疗设备厂)
3. CO₂培养箱 (Thermo Scientific公司)
4. 恒温振荡培养箱 (上海知楚仪器有限公司)
5. -80 °C冰箱 (Thermo Scientific公司)
6. 分光光度计 (日本岛津公司)
7. 酶标仪 (Thermo Scientific中国有限公司)
8. SPX-250B 型生化培养箱 (上海跃进医疗器械厂)
9. 电子天平 (BEL巴拉特电子有限公司)
10. 生物安全柜 (上海生叉科技有限公司)
    

实验步骤

本实验根据改良肉汤稀释法，测定待测化合物对指示菌的最低抑制浓度 (MIC，minimum inhibitory concentration)，具体方法如下 (以金黄色葡萄球菌为例，不同指示菌所采用的培养基不同)：

一、样品的准备 (均于生物安全柜内操作)

1. 将若干待测样品用DMSO配制成2 mg/ml的储备液若干。
   (DMSO能保证抗菌小分子化合物样品状态稳定，同时由于DMSO挥发性很低，故能保证储备液浓度不变，防止溶剂挥发造成的浓度变化)
2. 用灭完菌的培养基将样品稀释成若干200 µg/ml的溶液，于4 °C备用。

1. 取40 μl保存在甘油管中的指示菌，接入已灭菌的培养基试管中。
2. 将已接入指示菌的试管放置于37 °C，180 r/min的摇床中进行8 h活化。
3. 取适量活化好的菌株再次接入到新鲜的培养基中，在37 °C，180 r/min的摇床条件下培养 (此步为菌种扩大培养，可视情况省略)。培养期间通过对菌液OD值进行检测，使其生长至对数生长期，即OD值在0.6-0.8范围内可用。
4. 将活化好的菌液，经灭菌的培养基按1:1000稀释后，常温备用。

1. 取无菌的96孔板，空出最外面一圈，并向其中每孔加入200 μl无菌水。
   从第2列开始，向其余每孔中加入已灭完菌的培养基100 μl。在第4列第2孔中加入待测化合物储备液100 μl，吹打混匀后吸取其中的100 μl至第3孔，再次吹打混匀后再吸取其中的100 μl至第4孔中，如此连续倍半稀释至第6孔，并从第6孔中吸取100 μl弃去。最终化合物的浓度 (µg/ml)：100.00，50.00，25.00，12.50，6.25，3.13 (具体终浓度以具体实验为准)。第1列作为含药物的阳性对照，第2列作为不含药物的阴性对照，浓度同上样浓度梯度。(以氯霉素作为阳性对照，以10%的甲醇溶剂作为阴性对照)(唐潮等，2016)
2. 向c步（图2）的每孔中再加入所测菌株悬液100 µl (106-107 CFU/ml)，充分混匀。
3. 做3组平行实验。
4. 将96孔板放置于28 °C培养箱内，孵育16 h判断结果。

1. 孵育完成后，将96孔板取出，观察和记录所测化合物的最低抑菌浓度 (MIC)。
   MIC定义为：在培养16 h后，孔内微生物没有明显生长繁殖的最低化合物浓度。故当生长对照孔内细菌明显生长时，实验才有意义。
2. 如下图所示，可确定对应菌的样品的MIC值。
   
   
   图2. 当孵育16 h后，孔内微生物的生长情况 与阳性对照孔内生长情况相同时的最小浓度，即为我们所求的MIC值，如上图例中，浓度为4x即为该药物的MIC值。

注意事项

1. 1.严格做好防护工作，防止沾染各菌株从而损害人体健康。
   2.本实验需在生物安全柜中进行操作，且要注意保证操作时台面干净整洁，且无其他杂物，防止交叉污染影响实验结果。
   3.实验器具及培养基需要进行高压蒸汽灭菌。灭菌条件为121 °C，20 min，葡萄糖可采用过滤灭菌。在96孔板操作中要注意培养基和用具要无菌，操作时要注意气流方向和可能带菌的物品，手不要在上风处和96孔板上移动。
   4.孵化培养期间需关注菌体生长情况，保证良好的培养条件。
   5.向96孔板最外圈加无菌水是为了防止培养基蒸发从而影响实验结果。向96孔板添加液体时，不同液体需更换新的枪头防止混合污染。尽量控制枪头在悬液中差不多的高度取液，减少重力作用产生菌液沉降影响铺板的各孔菌体密度。需要注意枪头中不要有气泡，悬液打入孔板后，横向移出枪头，减少枪头尖端悬液残余。
   6.对菌液进行倍比稀释时，需注意充分吹打混匀菌液后再转入下一管中，防止菌体沉淀导致配制菌液浓度不准确。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。
   7.进行分光光度计及酶标仪检测时，需保证96孔板和比色杯中的液体内无气泡，否则会造成实验结果产生偏差。
   

溶液配方

1. 营养肉汤培养基（NB）
   配方 (/L)：蛋白胨10 g，牛肉膏粉3.0 g，氯化钠5.0 g，pH 7.4 ± 0.2
   (大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)
   阳性对照：氯霉素，阴性对照：10%甲醇
2. 脑心浸液肉汤 (BHI)
   配方 (/L)：蛋白胨10 g，脱水小牛脑浸粉12.5 g，脱水牛心浸粉5.0 g，氯化钠5.0 g，葡萄糖2.0 g，磷酸氢二钠2.5 g，pH 7.4 ± 0.2
   (溶藻性弧菌)
   阳性对照：氧氟沙星，阴性对照：10%甲醇
3. AHM (Aeromonas Hydrophila Medium) 鉴别培养基
   配方 (/L)：蛋白胨5.0 g，酵母浸膏3.0 g，胰酪蛋白胨10.0 g，L-盐酸鸟氨酸5.0 g，甘露醇1.0 g，肌醇10.0 g，硫代硫酸钠0.4 g，柠檬酸铁铵0.5 g，溴甲酚紫0.02 g，琼脂3.0 g，pH 6.6-6.8
   (嗜水气单胞菌)
   阳性对照：氟哌酸，阴性对照：10%甲醇
4. 耐万古霉素肠球菌鉴定培养基（VRE）
   配方 (/L)：酪蛋白和肉蛋白胨 (牛和猪) 18 g，心蛋白胨 (牛或猪) 3.0 g，玉米淀粉 1.0 g，氯化钠6.0 g，琼脂15.0 g，pH 7.2
   (耐万古霉素肠球菌)
   阳性对照：氨卞西林，阴性对照：10%甲醇
5. 甘露醇盐琼脂 (MSA)
   配方 (/L)：蛋白胨10.0 g，牛肉膏粉末1.0 g，D-甘露醇10.0 g，氯化钠75 g，酚红0.025 g，琼脂13.0 g，pH 7.4 ± 0.2
   (耐甲氧西林金葡菌)
   阳性对照：万古霉素，阴性对照：10%甲醇
6. 含0.5%酵母浸出液的Todd-Hewitt培养基 (THY)
   配方 (/L)：酵母浸膏5.0 g，细菌蛋白胨20.0 g，牛心浸粉3.1 g，碳酸钠2.5 g，葡萄糖2.0 g，氯化钠2.0 g，磷酸氢二钠0.4 g，琼脂15.0 g，pH 7.8 ± 0.2
   (耐多药肺炎链球菌)
   阳性对照：头孢噻肟，阴性对照：10%甲醇
   

致谢

本实验是在中国人民解放军海军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室完成的。感谢国家自然科学基金，国家重点研发计划，国家863计划等课题的资助。感谢杨妤硕士、艾峰硕士、施晓琼硕士、韩文菊硕士、龙聪硕士、方莎莎硕士、唐潮硕士、叶科元硕士等先前的研究工作对本实验的帮助。利用该方法发表的文章 （Lu et al., 2011; Lu et al., 2014; zhou et al., 2017; Yu et al., 2018）。

参考文献

1. 唐潮，叶科元，方莎莎，卢小玲，刘小宇，吴文惠. (2016). 北极真菌Nectria sp.B-13中酚醛倍半萜烯类化合物的研究. 中国海洋药物 35(05): 35-39.
2. Lu, X., Liu, X., Long, C., Wang, G., Gao, Y., Liu, J. and Jiao, B. (2011). A preliminary study of the microbial resources and their biological activities of the east China sea. Evid Based Complement Alternat Med 2011: 806485.
3. Lu, X. L., Liu, J. T., Liu, X. Y., Gao, Y., Zhang, J., Jiao, B. H. and Zheng, H. (2014). Pimarane diterpenes from the Arctic fungus Eutypella sp. D-1J Antibiot 67: 171-174.
4. Yu, H. B., Wang, X. L., Xu, W. H., Zhang, Y. X., Qian, Y. S., Zhang, J. P., Lu, X. L. and Liu, X. Y. (2018). Eutypellenoids A⁻C, new pimarane diterpenes from the arctic fungus Eutypella sp. D-1Mar Drugs 16(8): 284.
5. Zhou, Y., Zhang, Y. X., Zhang, J. P., Yu, H. B., Liu, X. Y., Lu, X. L. and Jiao, B. H. (2017). A new sesquiterpene lactone from fungus Eutypella sp. D-1 Nat Prod Res 31(14): 1676-1681.