高通量筛选乙酰转移酶活性抑制剂
High-throughput Screening of Acetyltransferase Inhibitors   

图文摘要



乙酰转移酶活性抑制剂的筛选实验总流程图。使用Multidrop和Bravo等自动化仪器将化合物稀释和分装到实验用384孔板内进行生化反应，随后利用Envision仪器测定实验信号，挑选出初筛阳性化合物。进一步应用Biacore 8K仪器开展二次筛选，并测定靶蛋白与化合物的亲和力。

材料与试剂

1. 96孔板 (Costar, 3879)
2. 96孔板 (Greiner, 650101) 
3. 384孔板 (PE, OptiPlate, 6007279) 
4. TCA (Sigma, T6399-100G) 
5. CPM (Sigma, C1484-25MG) 
6. Tris-HCl (Sigma, 10812846001) 
7. NaCl (Sigma, S9888-1KG) 
8. Glycerol (国药集团化学试剂有限公司, 10010618) 
9. TWEEN-20 (Beyotime, ST825) 
10. Sensor Chip CM7传感器芯片 (GE Healthcare, 29147020/29-1470-20) 
11. EDC (GE Healthcare, Amine Coupling Kit, BR-1000-50) 
12. NHS (GE Healthcare, Amine Coupling Kit, BR-1000-50) 
13. 乙醇胺 (GE Healthcare, Amine Coupling Kit, BR-1000-50) 
14. 醋酸钠 (GE Healthcare, Acetate 5.5, BR-1003-52) 
15. HBS (GE Healthcare, HBS-N buffer, 10x, BR-1006-70) 
16. DMSO (Sigma, D2650-100 ml) 
17. 化合物 (由中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台提供)
    

仪器设备

1. Multidrop自动分液器 (Thermofisher, model: Multidrop Combi) 
2. Bravo自动化液体处理平台 (Agilent, model: Bravo) 
3. Envision多标记微孔板检测仪 (PE, model: Envision) 
4. 离心机 (Eppendorf, model: 5810R) 
5. Biacore 8K (GE Healthcare, model: Biacore 8K)
   

实验步骤

一、生化水平酶活筛选系统

1. 化合物的准备
   绝大部分化合物溶解在100% DMSO中，储存浓度为10 mM，以96孔板 (Costar, 3879) 模式保存在-80 °C冰箱。室温平铺解冻，注意避光。解冻后离心129 × g，2 min。用Multidrop仪器向化合物板中加入缓冲液I，使化合物浓度稀释100倍至100 μM，震荡混匀后离心129 × g，2 min。384孔板反应体系中化合物的终浓度为10 μM，所以总共需要稀释1000倍，分两步完成。
   1.1

   化合物的100倍稀释

   1)

   准备Multidrop
   Multidrop安装好standard cassette后先放入含bleach的容器中prime 50 ml 10% bleach，之后将standard cassette的管路在充满10% bleach的状态下浸泡5 min，随后将standard cassette的另一端转移至含ddH₂O的容器中prime 200 ml ddH₂O以除去10% bleach。

   2)

   分配缓冲液I 将standard cassette的另一端转移至装有缓冲液I的容器中Prime少量体积后，向96孔板 (Costar, 3879) 的2-11列中每孔加入100 μl缓冲液I，之后向96孔板的第1列及第12列中加入100 μl含1% DMSO的缓冲液I。
   1.2

   化合物的10倍稀释
   化合物稀释至100 μM后利用Bravo液体工作站转移化合物至384孔反应板，每孔2 μl (酶活反应体系为20 μl)。
   
2. 酶活反应系统
   2.1

   酶活反应体系
   将酶蛋白和底物以及其它试剂从-80 °C移至冰上解冻，并用缓冲液I稀释至工作浓度。384孔板中1-2列为阳性对照体系，3-22列为实验体系，23-24列为阴性对照体系。实验的酶活反应总体系如下表所示(Dahlin et al.,2013)：
   
   

   反应组分	用量 (μl/well)	终浓度	总体积
   Enzyme	12	84 nM	30 μl
   Compounds	2	10 μM
   Substrate 1 & Substrate 2	6	4.2 μM 5 μM
   终止试剂Reagent 1	2.5	0.67%
   荧光探针Reagent 2 & Tris-HCl	7.5	10 μM 2 M

   
   
   2.2

   Multidrop加样

   1)

   准备Multidrop：
   Multidrop安装好small cassette后先放入含bleach的容器中prime 50 ml 10% bleach，之后将small cassette的管路在充满10% bleach的状态下浸泡5 min，随后将small cassette的另一端转移至含ddH₂O的容器中prime 200 ml ddH₂O以除去10% bleach。

   2)

   在384孔板的1-22列中加入稀释好的Enzyme溶液，23-24列加入缓冲液I，每孔12 μl。

   3)

   4 °C离心，129 × g，2 min。并在4 °C孵育15 min。

   4)

   在384孔板的1-24列中加入稀释好的Substrate 1溶液和Substrate 2溶液，每孔6 μl，4 °C离心，129 × g，2 min。

   5)

   在384孔板的1-24列中加入稀释好的终止试剂Reagent 1溶液，每孔2.5 μl，室温离心，129 × g，2 min。

   6)

   在384孔板的1-24列中加入稀释好的荧光探针Reagent 2和Tris-HCl，每孔7.5 μl。室温离心，129 × g，4 min。
   2.3

   Envision读板 通过酶标仪Envision检测384孔反应板各孔荧光信号。

二、酶蛋白与化合物亲和力测定
Biacore 8K的检测原理基于表面等离子共振 (SPR) 技术，可以用于研究分子之间的相互作用。该技术基本操作流程为：将一种互作分子固定在芯片表面作为配体，另一种互作分子作为分析物以流动相的形式流过芯片表面。仪器传感器对距离芯片表面约150 nm内光的折射率变化非常敏感，当物质结合在芯片表面时，入射光的折射将根据物质结合的量产生相应的折射率变化，仪器可将光的折射变化转换成结合信号 (即RU值)。芯片上结合的物质越多，其RU值越大。
测定酶蛋白与化合物亲和力，首先需要把配体 (酶蛋白) 通过氨基偶联的方式固定在CM7芯片上，然后将一定浓度的化合物流经芯片表面，观察传感器捕捉的结合信号，通过与DMSO对照组的响应值进行比较，区分出与酶蛋白分子有结合的小分子化合物。本实验分为单浓度筛选和多浓度测定亲和力两个步骤。

1. 单浓度筛选可与酶蛋白结合的化合物
   1.1

   化合物的准备 绝大部分化合物溶解在100% DMSO中，储存浓度为10 mM，以96孔板 (Costar, 3879) 模式保存在-80 °C冰箱。室温平铺解冻，注意避光。解冻后离心129 × g，2 min。将化合物用缓冲液分两步稀释1000倍至10 μM，震荡混匀后离心129 × g，2 min。
   1.2

   单浓度筛选

   1)

   清库。用稀释好的化合物流经未经处理的CM7芯片表面，查看结合数据，如果响应值异常高，则认为是非特异性黏附在芯片上的化合物，应予以剔除。

   2)

   配体的预富集。正式偶联之前，需要进行配体的预富集，以确定最佳的偶联浓度和pH条件。分别取1 μl配体，加入到99 μl不同pH的醋酸钠缓冲液中 (10 mM sodium acetate，pH 5.5、5.0、4.5) 充分混匀，配体的最终浓度约为10 μg/ml。如有气泡，可离心去除。通过Biacore上机检测不同pH条件下配体响应值 (图1)，选择在醋酸钠溶液中静电吸附最强即响应值最高的pH作为最佳偶联条件。本实验选择pH 5.5为最佳条件。
   
   
   图1. 不同pH条件下配体蛋白的偶联情况示意图 图中绿色 (CH1)、黄色(CH2) 和蓝色 (CH3) 曲线分别代表在醋酸钠溶液pH 4.5、5.0和5.5缓冲条件下，配体蛋白的偶联量。
   
   

   3)

   计算配体需要的偶联量，根据所需偶联量选择合适芯片。由公式R_L = MW_ligand × R_max / ( MW_analyte × S_m) 计算得到，其中RL指配体偶联水平，MW_ligand指配体的相对分子质量，MW_analyte指分析物的相对分子质量，R_max指芯片表面最大结合容量，在小分子测试中一般设为100 RU，S_m指化学计量比，未知时设为1。如果所需偶联量小于20,000，选择CM5芯片，偶联量大于20,000可选择CM7芯片。本实验选择CM7芯片。

   4)

   用EDC和NHS对芯片进行活化，然后偶联配体蛋白，最后利用Ethanolamine进行封闭。本次实验将配体固定在channel 1-8的flow cell 2 (Fc2) 上，而flow cell 1 (Fc1) 作为参比通道只做活化、封闭，不进行配体固定。Biacore 8K操作软件依据输入的各参数计算出每种试剂所需体积，并给出各试剂在96孔板中的排布位置。按照软件提示，依次将每孔89 μl EDC分装在Plate 1的第1列 (共准备89 × 8 μl以上的EDC)，每孔89 μl NHS分装在第2列，每孔210 μl，10 μg/ml配体 (溶在pH 5.5的醋酸钠中) 分装在第4列，每孔129 μl Ethanolamine分装在第5列。根据软件提示，Plate 1的第3列用缓冲液II补齐。将96孔板放置在对应样品的指定Plate位置上并锁定，上机操作。

   5)

   偶联 (Immobilization) 程序运行结束后，点击Biacore 8K Control Software主界面上方的Runs，找到结果文件查看最终配体蛋白偶联情况 (图2)，本实验channel 1-8的flow cell 2上的配体偶联量都达到了预期。点击Sensorgram可查看偶联全过程。
   
   
   图2. 最终配体蛋白偶联情况示意图 Ch1至Ch8分别展示了8个通道的偶联情况。
   
   

   6)

   待传感曲线基线Baseline稳定后，开始预设程序检测小分子与酶蛋白结合情况。在程序一开始，运行至少3个零浓度使传感曲线基线稳定，然后上机96孔板中的分析物 (10 μM) 检测小分子与酶蛋白的结合情况。

   7)

   数据分析。首先查看结合数据，如果响应值异常高，大于5倍Rmax，则认为该数据存在异常，应予以剔除。点击传感图下方的Quality Control，即可呈现系统对数据拟合结果进行智能化评估的结果。绿色打勾图标表明结果符合模型要求，是高质量的数据结果。黄色惊叹号图标表明部分结果比较接近模型预期的临界状态，需要进一步检查数据。红色惊叹号图标说明结果有不符合模型的地方，需要着重分析原因。根据与DMSO对照组的结合响应值进行比较，化合物的RU响应值大于AVERAGEDMSO ± 3*SDDMSO，则该化合物被定为能与酶蛋白相结合的阳性hit，将开展后续亲和力测定实验。
2. 酶蛋白与化合物的亲和力测定
   经过单浓度筛选，确定了与酶蛋白有结合的小分子化合物。接下来进行化合物与酶蛋白亲和力测定。在本次实验中，我们对化合物进行了系列浓度梯度稀释。根据预实验确定化合物最高浓度为100 μM，后续浓度以2倍比例进行梯度稀释，最终每种化合物设置10个浓度点。实验中所有化合物运行遵循从低浓度到高浓度的进样顺序。本次实验无再生过程。
   2.1

   化合物浓度梯度制备
   将单挑出来的化合物在室温解冻，注意避光。解冻后离心129 × g，2 min。利用移液器手动将化合物稀释100倍 (HBS buffer)，制成100 μM的化合物，然后按照顺序转移至Biacore 8K制样板96孔板 (Greiner, 650101) 的第1列，每孔250 μl。接下来分两步进行浓度梯度稀释：

   1)

   利用Multidrop仪器在96孔板 (Greiner, 650101) 的第2-10列加入等量缓冲液II，每孔120 μl。

   2)

   利用Bravo液体工作站进行2倍连续梯度稀释，从第1列吸120 μl至第2列，进行mix吸打混匀。循环上述操作至第10列，完成化合物浓度连续稀释。
   2.2

   测定亲和力

   1)

   酶蛋白氨基偶联。用EDC和NHS对CM7芯片进行活化，然后偶联配体蛋白，最后利用Ethanolamine进行封闭。本次实验将配体固定在channel 1-8的flow cell 2 (Fc2) 上，而flow cell 1 (Fc1) 作为参比通道只做活化、封闭，不进行配体固定。Biacore 8K操作软件依据输入的各参数计算出每种试剂所需体积，并给出各试剂在96孔板中的排布位置。根据软件提示，依次将每孔89 μl EDC分装在Plate 1 的第1列 (共准备89 × 8 μl以上的EDC)，每孔89 μl NHS 分装在第2列，每孔210 μl，10 μg/ml配体 (溶在pH 5.5的醋酸钠中) 分装在第4列，每孔129 μl Ethanolamine分装在第5列。根据软件提示，Plate 1的第3列用缓冲液II补齐。将96孔板放置在对应样品的指定Plate位置上并锁定，上机操作。

   2)

   偶联 (Immobilization) 程序运行结束后，点击Biacore 8K Control Software主界面上方的Runs，找到结果文件查看最终配体蛋白偶联情况，本实验channel 1-8的flow cell 2上的配体偶联量都达到了预期。点击Sensorgram可查看偶联全过程。

   3)

   基线稳定及程序运行。在程序一开始，运行至少3个零浓度使传感曲线基线稳定。待传感曲线基线Baseline稳定后，开始运行预设程序检测小分子与酶蛋白结合情况。

   4)

   数据分析，得到每个化合物对应KD值。首先查看结合数据，如果响应值异常高，大于5倍R_max，则认为该数据存在异常，应予以剔除。
   点击传感图下方的Quality Control，即可呈现系统对数据拟合结果进行智能化评估的结果。绿色打勾图标表明结果符合模型要求，是高质量的数据结果。黄色惊叹号图标表明部分结果比较接近模型预期的临界状态，需要进一步检查数据。红色惊叹号图标说明结果有不符合模型的地方，需要着重分析原因。传感线经软件拟合所得R_max应与根据实际偶联量计算得到的R_max相近，ChI应小于1/10 R_max。
   点击传感图下方的Residuals，即可直观表现传感图中实际曲线和拟合曲线之间的离散情况。如果大部分的点都位于绿色直线范围之内，表明拟合曲线非常符合实际的数据曲线。如果超出红色直线范围，表明拟合结果的偏差较大，需要具体分析原因。此外，根据Residuals可知，有一些浓度的离散程度较高，可删除此浓度，重新进行拟合，但要保证留下的浓度应为连续浓度。

实验注意要点

1. 本次实验中，为保证酶蛋白的活性，酶蛋白溶液的配制以及与小分子化合物的孵育过程都在低温条件下操作。
2. 实验系统中若有荧光试剂，应采取避光措施。例如，筛选所用多孔板的板盖在实验前用锡箔纸包裹。
3. 有一些试剂直接用缓冲液稀释可能会出现不溶解的现象，例如CPM，可以先用原溶剂DMSO进行2-10倍稀释后，再用缓冲液进行稀释。
4. 生化水平荧光信号的检测，优先选择全黑板进行实验。
5. 某些情况下，可向生化水平筛选所用缓冲液中添加适当的去除非特异性结合的试剂，有利于提高信噪比。例如BSA，Tween20等。
6. 缓冲液最好现配现用，实验前用0.22 μm滤膜过滤。
7. 化合物一般以10 mM储存在100% DMSO中，从DMSO相到水相的稀释比例不低于1:100，以保证化合物的充分溶解。
8. 本次实验目的是要筛选可以和靶蛋白结合的小分子化合物，该类实验宜将靶蛋白作为配体，将待筛选的小分子化合物作为分析物。这种情况下，所需的配体偶联量通常较高，应优先选择氨基偶联的方式来固定配体。如果所需偶联量小于20,000 RU，通常选择CM5芯片；当所需偶联量大于20,000 RU时，应选择CM7芯片。经计算，本实验所需偶联量大于20,000 RU，故选择CM7芯片。
   

溶液配方

1. 缓冲液I：20 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，5% glycerol。现配现用，0.22 μm滤膜过滤。
2. 缓冲液II：HBS + 1% DMSO。现配现用，0.22 μm滤膜过滤。
   

致谢

该研究得到国家自然科学基金重大研究计划重点项目 (基金号：91853204) 的资助，感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台的大力支持。

参考文献

1. Dahlin, J. L., Sinville, R., Solberg, J., Zhou, H., Han, J., Francis, S., Strasser, J. M., John, K., Hook, D. J., Walters, M. A., Zhang, Z. A. (2013).Cell-Free Fluorometric High-Throughput Screen for Inhibitors of Rtt109-Catalyzed Histone Acetylation. PLoS ONE 8(11): e78877.