摘要:基于片段的药物发现 (FBDD) 被视为一种功能强大的搜索引擎,可在研发早期 识别那些与疾病相关的靶标蛋白相结合的分子片段,从而推进药物研发过程。这些覆盖更大化学空间的分子片段可用于快速、经济、有效地评估靶标蛋白的可成药性。核磁共振 (NMR) 技术在该应用领域具有独一无二的优势,可直接并快速地识别弱结合 片段。随后这些弱结合片段经过化学优化后,进一步产生有效的候选药物分子。不同于基于蛋白质的NMR观察技术,基于配体观察的实验利于发现弱的、短暂的配体与靶标蛋白之间的结合。大的蛋白质分子显著不同的弛豫等特性转移到与之结合的配体小分子上,从而达到区分结合前后配体分子的目的。快速的解离速率 (Koff) 使样品中相 对过量的配体在溶液中仍保持NMR可测的结合蛋白质的特性。目前有大量的NMR实验方法可用于结合配体检测,如核奥氏效应 (NOEs)、化学位移扰动 (CSP)、饱和转 移差谱 (STD)、WaterLOGSY、T2/T1rho-弛豫波谱以及扩散序谱 (DOSY)。而得益于 高灵敏度、高耐用性以及易于使用的特点,基于T2-弛豫的19F NMR在上述众多筛 选技术中脱颖而出,得到了广泛的应用。由于氟化配体通常只有单一的19F信号,即便利用超过20个配体的混合物同时进行筛选,也无信号重叠问题,从而显著提升了样品的筛选通量。此外,19F检测不仅无需溶剂峰压制,而且也无需对靶标蛋白信号 进行弛豫滤波,进一步简化了实验方法。本文将详细介绍完整的19F NMR筛选工 作流程。
关键词: 基于片段的药物发现, FBDD, 19F NMR, 筛选, T2弛豫, CPMG
材料与试剂
- 重水 (D2O)
- 二甲亚砜 (DMSO)
- 超纯水 (H2O)
- 甲酸 (FA)
- 乙腈 (ACN)
- 三羟甲基氨基甲烷 (Tris)
- 盐酸 (HCl)
- 氯化钠 (NaCl)
- 磷酸三氯乙酯 (TCEP)
- 缓冲液 (根据不同的研究对象需要不同的配方,如50 mM Tris pH 7.5,150 mM NaCl,1 mM TCEP)
- 液相色谱流动相 (0.1% FA in H2O/ACN)
仪器设备
- NMR波谱仪 (Bruker)
- Quadrupole LC/MS (Agilent)
- 离心机 (Thermo)
实验步骤
- NMR配置和附件
相比于1H NMR的片段筛选方法,19F NMR筛选不仅能混合更多的配体化合物, 还能降低蛋白质和配体的浓度,从而提高了筛选和准确识别的效率,达到了节约时间和成本的双重目的。 - NMR筛选工作流程
下图为筛选流程图 (图2),主要包括片段分子质量检查、片段混合物制作、筛选以及分析过程,下文将进行逐步详细介绍。
图2. NMR筛选工作流程图
- 片段分子质量检查 (QC)
全套质量检查需应用于所有候选分子 (即片段分子),以用于剔除“低质量”的化合物 (如,错误的片段、错误的浓度、被污染或降解的化合物)。LC/MS可用于验证化合物的质量,并对所有杂质进行定量分析。一维1H和19F NMR可用于测定化合物 的结构、纯度、浓度以及在水溶液中的溶解度,也可用于谱图质量分析。 - 片段混合物的制作
片段库可通过市场上可购买的或实验室自有的含19F片段分子来构建。片段库设计需在化学空间上达到最大覆盖率并遵循RO3原则 (Congreve et al., 2003)。
为了提高NMR筛选方法的通量,通常将多个片段混合同时进行测定。而在19F 筛选实验中,混合物可包含15到30个片段。在设计过程中,需多加注意,避免混合物19F谱中出现片段谱峰重叠现象。一旦完成混合物设计,便可将其应用于所有的筛选实验。
CF3和CF/CF2基团的氟原子数和弛豫特性有所不同,因此针对两类基团需分别进行片段分子混合,并使用不同的实验参数 (化合物浓度、氟谱谱宽、弛豫滤波的时间等) 进行筛选。
Mnova MixDesign软件 (图6) 可自动完成片段混合物的设计。根据设计结果制备混合物,并将混合物溶于DMSO中,储存于-20 °C备用。
图6. 片段混合物设计的堆叠视图
- 筛选样品的制备
- NMR实验/筛选
19F谱检测是通过Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) 实验来实现的,需分别检测不含蛋白质的样品 (即空白样品) 和含有蛋白质的样品,随后评估两个样品之间谱峰强度的变化。相比CPMGblank,如果某个谱峰的强度在CPMGprotein实验中降低了,并下降幅度超过了一个预定义的阈值,那么该化合物被标记为命中。反之,没有变化或谱峰强度变化很小,那么这表明该化合物没有与靶标相结合,因此不被标记为命中。所以说,通过比较筛选样品和参考谱图,可以揭示该化合物是否与靶标蛋白有结合 (图7)。
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图7. 模拟19F 信号: P1 和P3在含有蛋白质的样品中降低了, 而P2保持不变,说明1号和2号化合物为命中化合物
TopSpin配置了标准的CPMG NMR实验 (如SCREEN_19F_T2),且该实验 设计的初衷便是让实验简单易用且能自动化运行。该实验是一个测定19F的假二维实验,通过预设的VCLIST,设置两个自旋回波的循环次数进行不同长度的T2滤波,默认值为0 (无CPMG滤波) 和5 (有CPMG滤波)。如前所述,由于CF3和 CF/CF2基团具有不同的弛豫特性,因此建议对其采用不同的实验设置。
实验步骤: - 筛选结果分析
如下截图所示 (图9),布鲁克TopSpin内置的片段筛选工具 (FBS) 可对数据进行手动分析以及查看。
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图9. FBS中筛选数据谱图
筛选窗口内提供了一些链接,能可视化片段混合物概况以及查看单个片段信号 (图10)。
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图10. FBS中筛选数据的概况
FBS可将数据规整起来,从而Mnova Screen软件可直接进行后续的自动命 中分析 (Peng et al., 2016)。
布鲁克与牛津大学的Y. Dubianok最近展开了合作,对NUDIX水解酶 (NUDT5 二聚体)进行了19F NMR筛选 (Dubianok et al., 2019)。实验使用的含氟片段库购于英国康沃尔Key Organics有限公司。该研究使用了布鲁克700 MHz磁体, AVANCE NEO谱仪,并配备了QCIF Helium CryoProbe探头进行筛选, 采用了19F{1H} CPMG实验方法。从片段筛选中,研究人员得到了若干命中化合物, 并从中挑选了16个, 用于进一步的X射线衍射表征。其中50% 的化合物成功 得到了X射线蛋白质/片段晶体结构,并被录入PDB (蛋白质数据库),这说明了 NMR筛选技术的高效率产出。图11和12展示了其中一个命中化合物的例子 (片段1R-0641)。结果编辑器 (图11)中可显示所有样品 (实验栏)中所有配体 (片段列) 的状态。下拉菜单可显示其他结果,如谱峰积分的平均/最大变化,匹配峰的百分比,以及每个配体的名称。双击实验选项可显示相应的波谱文件,其中包含单个和堆叠视图,以便进行可视化分析验证。
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图11. 筛选分析结果概况 颜色编码: 蓝色代表命中,橙色代表存在,红色代表缺失。片段1R-0641为蓝色命中。
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图12. Mnova Screen可自动进行19F筛选分析
基于配体检测NMR筛选的优势之一,是对靶标的尺寸没有大小限制。Binas et al. (2021)提供了一个真实存在的案例。文中,研究人员对具有不同二级和三级结构的14个RNA靶标进行了19F NMR筛选,以系统地评估RNA的可成药性。通过对 RNA靶标进行片段筛选,命中率高达26%。而这些针对RNA的应用目前显得尤为重要,因为这项研究将有助于识别具有抗病毒活性的新配体,以用于对抗新冠肺炎病毒大流行。
后续验证:
由于受到交换展宽等效应的影响,筛选实验中得到的信号变化结果 (即结合时增加的弛豫速率) 与配体的亲和力大小无正比关系。通常情况下,筛选后需要进一 步对命中化合物进行排位和确认。现有常用技术包括竞争NMR法、基于靶标的2D NMR法、优化的19F NMR实验 (CSAR,基于化学位移各向异性的亲和力排位) 或X射线衍射等。这方面的内容在此不作详细讨论。
注意事项
如需在实验室中开展基于片段的筛选工作,建议先利用已知结合模型的样品进行测试,以确保整个实验流程能顺利运行。利用这些样品优化参数,获得最佳的结果,这对后续定制化筛选实验也大有帮助。
致谢
文中部分数据来自于之前在诺华的工作,感谢Andreas Lingel的支持。我们还特别感 谢Donna Baldisseri、Ian Clegg和Anna Codina对全文的审校工作
参考文献
- Bruker Fragment-based Screening. Brochure. https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr-pharma-solutions/lead -discovery-and-optimization.html
- Mnova and MGears software. https://mestrelab.com/
- Congreve, M., Carr, R., Murray, C. and Jhoti, H. (2003). A 'rule of three' for fragment-based lead discovery? Drug Discov Today 8(19): 876-877.
- Lingel, A., Vulpetti, A., Reinsperger, T., Proudfoot, A., Denay, R., Frommlet, A., Henry, C., Hommel, U., Gossert, A. D., Luy, B. and Frank, A. O. (2020). Comprehensive and high-throughput exploration of chemical space using broadband 19F NMR-based screening. Angew Chem Int Ed Engl 59(35): 14809-14817.
- Peng, C., Frommlet, A., Perez, M., Cobas, C., Blechschmidt, A., Dominguez, S. and Lingel, A. (2016). Fast and efficient fragment-based lead generation by fully automated processing and analysis of ligand-observed NMR binding data. J Med Chem 59(7): 3303-3310.
- Dubianok, Y., Krojer, T., Kovacs, H., Moriaud, F., Wright, N., Strain-Damerell, C., Burgess-Brow, N., Bountra, C., Arrowsmith, C. H., Edwards, A., von Delft, F.. (To be published). (2019). PanDDA analysis group deposition - Crystal Structure of NUDT5 in complex with 1R-0641.
- Binas, O., Jesus, V. D., Landgraf, T., Völklein, A. E., Martins, J., Hymon, D., Bains, J. K., Berg, H., Biedenbänder, T., Fürtig, B., Gande, S. L., Niesteruk, A., Oxenfarth, A., Qureshi, N. S., Schamber, T., Schnieders, R., Tröster, A., Wacker, A., Wirmer-Bartoschek, J., Martin, M. A. W., Stirnal, E., Azzaoui, K., Richter, C., Sreeramulu, S., Blommers, M. J. J. and Schwalbe, H. (2021). 19F NMR-based fragment screening for 14 different biologically active RNAs and 10 DNA and protein counter-screens. ChemBioChem 22(2): 423-433.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:邓惠文, Fabrice Moriaud. (2021). 基于
19F核磁共振的高通量片段筛选. // 高通量筛选实验手册.
Bio-101: e1010874. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010874.
How to cite: Deng, H. W. and Moriaud, F. (2021).
19F NMR Based High Throughput Fragment Screening. // High-throughput Screening Protocol eBook.
Bio-101: e1010874. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010874.