高通量蛋白质稳定性鉴定和buffer条件筛选
High Throughput Protein Stability Identification and Buffer Screening   

材料与试剂

1. 10 µl，200 µl移液枪头 (NEST, catalog number: 301006,302106)
2. 1000 µl移液枪头 (QSP, catalog number: 112NXL-Q)
3. 1.5 ml EP管 (ExCellBio, catalog number: CS015-0041)
4. 50 ml 离心管 (Corning, catalog number: 430829)
5. 密封条 (Unchained Labs, catalog number: 201-1013)
6. UNi管 (Unchained Labs, catalog number: 201-1010)
7. 溶菌酶 (Macklin, catalog number: L6051-25g)
8. Stock Options pH筛选试剂盒 (Hampton Research, catalog number: HR2-241)
9. 超纯水 (经过超纯水仪过滤后的去离子水)
10. Stock Options pH筛选试剂盒中16种pH值缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 蛋白质稳定性检测仪 (生产商：美国Unchained Labs，model: UNcle)
2. 4度高速离心机 (Thermo Scientific, model: Sorvall Legend Micro 17)
3. 移液器 (Thermo Scientific, model: Finnpipette F1)
   

软件

1. UNcle Client 5.03
2. UNcle Analysis 5.03
   

实验步骤

一、样品溶液制备

1. 溶菌酶溶液母液：
   取溶菌酶样品40 mg，溶解到1 ml的超纯水中，轻微震荡5 min，用移液枪头轻轻吹打达到完全溶解后，放置到冰上1 h后，作为母液备用。
2. Stock Options pH筛选试剂盒：
   商业购买，开封后放置于4 °C恒温间储存，用于筛选实验。
3. 16种不同pH条件的溶菌酶溶液制备：
   从1中的溶菌酶母液中分别取16份50 µl母液到16个1.5 ml的EP管中，再将Stock Options pH筛选试剂盒中pH值为4.0, 4.2, 4.4, 4.6, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2的缓冲溶液分别取10 µl，加到之前的16个1.5 ml的EP管中，并分别再加入40 µl的超纯水混匀，将溶菌酶置换到16种缓冲溶液终浓度为5 mg/ml，最后使用4 °C高速离心机，12,000 × g转速离心2 min后，放置冰上，以备稳定性检测。

1. 打开电脑和UNcle开关 (位于仪器背面右下角)，待仪器与电脑USB连接成功 (四声叮咚之后)，打开UNcle Client软件；选择“Operator”，输入密码“UNcle”登录；选择“Applications”，在下图1应用列表中选择需要的应用方法。
   
   
   图1. 应用列表
   
   
2. Tm&Tagg with DLS应用实验
   2.1

   在图1应用列表中选择“Tm & Tagg with optional DLS”应用，在下图2中Projects界面中选择UNcle Project，创建New run。
   
   
   图2. Projects界面
   
   
   2.2

   下一步导入Sample set：首先打开Excel，输入样品信息，保存。然后回到Client界面，点击“Import Sample Set”，搜索以上创建Excel文件，点击“Open”-“Next”，进入“New Sample Set”界面，在“Set Name”后输入名称，勾选“Available in all Projects”；点击“Save”。
   2.3

   下一步进入“Populate wells with samples”界面，把样品名字拖拽到相应孔位置，按照显示的加样设置，每个样品取9 μl，加入UNi对应孔，上下用密封条封闭，装进蓝色Frame ，如下图3(Unchained Labs,2017)所示，然后点击“Finish”。
   
   
   图3. 加样品到UNi管中的操作
   
   
   2.4

   取16种pH条件的溶菌酶溶液的9 μl样品,每个样品重复3个孔，共48孔，需加至3根UNi管中，同时放置在仪器样品仓中进行检测。
   2.5

   此次实验可一次高通量检测48个样品，同时检测蛋白粒度及多分散性、熔解温度 (Tm) 和开始聚集温度 (Tagg)。蛋白内源性荧光 (IF) 用来检测Tm；静态光散射 (SLS) 用来检测Tagg；DLS用以检测蛋白当前状态粒度或聚集情况。
   2.6

   UNcle Client 5.03软件设置检测参数：下一步进入“Please configure your experiment”界面，如图4所示，分为上下两个设置版块，分别是DLS参数设置和升温曲线参数设置。DLS参数设置，每个样品检测4次，每次5 s，仪器会在升温开始和结束后分别检测DLS数据。升温参数设置Start Temp为28 °C、End Temp为95 °C和Rate升温速率为0.25 °C/min，Plate hold time保持32 s无需调整，点击“Apply”。
   
   
   图4. “Please configure your experiment”界面
   
   
   2.7

   点击“load samples”，将载样UNi放入仪器内样品台，然后点击“Manual Configuration”。将鼠标定位至其中一个样品孔 (左击)，然后点击右下角“Trigger”，观察右上角荧光光谱曲线区域，通常蛋白内源荧光激发光谱会在300-400 nm之间呈正态分布峰，点击“Next”；进入“Please configure your DLS settings”界面，勾选“Auto”，其他参数保持默认值，待DLS Intensity平稳后点击右下角“Start”，开始实验。
   2.8

   实验结束后用分析软件UNcle Analysis 5.03自动计算Tm&Tagg，默认BCM (Barycentric mean) 方法分析Tm。
3. Isothermal Stability (等温稳定性实验)
   3.1

   参照上面实验步骤2中的 (1)-(4)，在图1应用列表中选择“Isothermal Stability”应用，并在UNi管中加上相同的样品，放置在仪器样品仓中待检测。
   3.2

   此次实验可一次高通量检测48个样品，将蛋白溶液放置UNcle内固定温度孵育，并实时检测蛋白 IF、SLS、DLS信号，追踪蛋白变性和聚集速率，及早发现蛋白稳定性变化，在Tm&Tagg基础上进一步区分缓冲条件稳定性。
   3.3

   UNcle Client 5.03软件设置检测参数：将等温孵育温度为37 °C，孵育时间为24 h，检测间隔设为设为40 min/次。
   3.4

   参照上面实验步骤2中的 (7)，开始实验。
   3.5

   实验结束后用分析软件UNcle Analysis 5.03自动计算结果。

结果与分析

1. 蛋白初始状态 (25-27 °C) 粒度分布结果。
   根据图5相关函数曲线可知16个缓冲液条件中分子粒径大小不一，大致可分为两组；由图6光强分布显示pH 7.0 – pH 8.2的众数粒径集中在 4 nm附近，约为溶菌酶单体粒径；pH 4.0 – pH 5.8众数粒径在200 nm附近，推测为溶菌酶聚集体。由图7质量分布峰可知pH 7.0 – pH 8.2的主要质量粒径分布集中在4 nm左右，pH 4.0 – pH 5.8主要质量粒径分布集中在200 nm左右粒径成分。因此，得出pH 4.0 – pH 5.8和pH 7.0 – pH 8.2条件是溶菌酶分别以两种不同聚集体形态存在于溶液中的条件。
   
   
   图5. 相关函数曲线
   
   
   图6. 光强分布峰
   
   
   图7. 质量分布峰
   
   
2. Tm&Tagg结果
   如图8所示和表1所示，变性曲线 (BCM曲线) 叠加可通过转折点对应温度直观判断各个缓冲条件下结构热稳定性差异，在pH 5.0条件下变性曲线红移转折点最晚，即Tm最高，结构热稳定性最优；pH 4.0 – pH 7.0条件下Tm在73-76 °C之间，普遍高于pH 7.2 – pH 8.2组 (Tm在69-72 °C)，因此偏酸的条件下更有利于蛋白保持高级结构。
   
   
   图8. 变性曲线叠加
   
   表1. Tm&Tagg平均值
   

   Sample	Tm Average	Tagg Average
   5 mg/ml pH 4.0	74.6	56.6
   5 mg/ml pH 4.2	74.9	57.4
   5 mg/ml pH 4.4	75.1	57.1
   5 mg/ml pH 4.6	75.7	57.2
   5 mg/ml pH 5.0	76	43.8
   5 mg/ml pH 5.2	74.4	43.1
   5 mg/ml pH 5.4	73.4	43.5
   5 mg/ml pH 5.6	73	43.6
   5 mg/ml pH 5.8	73	35.7
   5 mg/ml pH 7.0	74.1	46.8
   5 mg/ml pH 7.2	71.7	45.9
   5 mg/ml pH 7.4	70.5	43.2
   5 mg/ml pH 7.6	69.7	40.7
   5 mg/ml pH 7.8	69.6	41.5
   5 mg/ml pH 8.0	70.9	38
   5 mg/ml pH 8.2	72.1	36.3

   
   如图9所示，聚集曲线 (SLS266) 叠加通过横坐标峰值对应温度以及纵坐标散射光强度，发现蛋白在pH 4.0 – pH 4.6条件下聚集温度高，说明聚集较晚，且信号强度弱，说明聚集程度低，因此稳定性更好；pH 7.6 – pH 8.2条件下蛋白聚集温度低，说明聚集更早，且信号强，说明聚集程度高，因此胶体稳定性较差，容易形成不规则聚集。
   
   
   图9. 聚集曲线 (SLS266) 叠加
   
   
3. 等温稳定性结果
   3.1

   结构动力学稳定性结果：
   如图10所示，pH 5.0/5.2/5.4/5.6/5.8和pH 8.0/8.2 BCM曲线明显偏高，如图11所示，AREA下降速率较快，说明蛋白解折叠较快，即动力学稳定性较低；
   如图10所示，pH 4.0/4.2/4.4/4.6和pH 7.0/7.2/7.4/7.6/7.8 BCM曲线整体偏低，如图11所示，AREA曲线下降速较慢，说明蛋白解折叠速率较慢，即动力学稳定性较高。
   
   
   图10. BCM曲线
   
   
   图11. AREA曲线
   
   
   3.2

   聚集动力学稳定性结果：
   如图12所示，pH 5.0/5.2/5.4/5.6/5.8和pH 7.6/7.8/8.0/8.2的SLS266曲线明显上升，表示蛋白产生聚集；pH 4.0/4.2/4.4/4.6的SLS266曲线最稳定，基本始终保持水平，推测无明显蛋白聚集体产生，即聚集动力学稳定性较高。
   
   
   图12. SLS266曲线
   
   
   3.3

   综上所述，通过高通量、全方面、多层次的分析检测之后，在选取的16种pH条件中，pH 4.0 – pH 4.6条件下的溶菌酶在溶液中的稳定性较好。

失败经验

1. 为了保证实验结果的准确性，关于Tm&Tagg实验升温速率及plate hold time，推荐参数设置如下表2：
   
   表2. 推荐参数设置
   

溶液配方

1. Stock Options pH筛选试剂盒中16种pH值缓冲液配方如下表3所示：
   
   表3. 16种pH值缓冲液配方
   

   pH：	Reagent：	Titrant
   pH 4.0	1.0 M Sodium acetate trihydrate	Hydrochloric acid
   pH 4.2	1.0 M Sodium acetate trihydrate	Hydrochloric acid
   pH 4.4	1.0 M Sodium acetate trihydrate	Hydrochloric acid
   pH 4.6	1.0 M Sodium acetate trihydrate	Hydrochloric acid
   pH 5.0	1.0 M Sodium citrate tribasic dihydrate	Hydrochloric acid
   pH 5.2	1.0 M Sodium citrate tribasic dihydrate	Hydrochloric acid
   pH 5.4	1.0 M Sodium citrate tribasic dihydrate	Hydrochloric acid
   pH 5.6	1.0 M Sodium citrate tribasic dihydrate	Hydrochloric acid
   pH 5.8	1.0 M Sodium citrate tribasic dihydrate	Hydrochloric acid
   pH 7.0	1.0 M HEPES sodium	Hydrochloric acid
   pH 7.2	1.0 M HEPES sodium	Hydrochloric acid
   pH 7.4	1.0 M HEPES sodium	Hydrochloric acid
   pH 7.6	1.0 M HEPES sodium	Hydrochloric acid
   pH 7.8	1.0 M HEPES sodium	Hydrochloric acid
   pH 8.0	1.0 M TRIS hydrochloride	Sodium hydroxide
   pH 8.2	1.0 M TRIS hydrochloride	Sodium hydroxide

   
   

致谢

本文得到清华大学国家蛋白质研究技术中心的资助。本文得到美国Unchained Labs公司的仪器工程师马春花的帮助。

参考文献

1. Unchained Labs. Uncle Instrument and Client Software User Guide.Revised 3/2017.