摘要:蛋白质晶体学是利用蛋白质晶体的X射线衍射数据来分析生物大分子三维精细结构的学科,其中主要的研究步骤之一是蛋白质晶体的获得,而结晶制备过程是需要大量的生长条件来进行筛选的,通过全自动化、高通量的设备可为繁复的结晶筛选试验提供快速简便的技术支持。本文利用TECAN全自动液体处理工作站Freedom EVO来实现蛋白质结晶筛选池液的高通量分装制备,介绍如何将96个条件的池液通过8通道快速分装到96孔的蛋白结晶板的池液孔中,可以实现最多220块晶体板的自动化分装。其中的蛋白质结晶筛选池液以Crystal ScreenTM和Crystal Screen 2TM试剂盒为例。
关键词: 高通量, 分装制备, 蛋白质结晶筛选试剂盒
材料与试剂
- 96孔晶体板 (Swissci, catalog number: 3W96TUVP)
- Crystal ScreenTM试剂盒 (Hampton Research, catalog number: HR2-110)
- Crystal Screen 2TM试剂盒 (Hampton Research, catalog number: HR2-112)
- Additive Screen试剂盒 (Hampton Research, catalog number: HR2-428)
仪器设备
- 全自动液体处理工作站 (Tecan, model: Freedom EVO)
- 自动封膜机 (BRANDEL, model: RS-232)
实验步骤
- 晶体板的准备工作:
将220块晶体板放置在舱中,从位置1开始,从上到下开始放置,和标记编号以及日期,如图1所示。
图1. 220块晶体板放置舱
- 清洗用的纯水的准备工作:
在清洗用水的桶中加满水,并将废液桶中的水倒空。 - 自动封膜机的准备工作:
将封膜机上的胶带更换一卷新的,以备封膜使用。 - 试剂盒的准备工作:
将Crystal ScreenTM试剂盒和Crystal Screen 2TM试剂盒的前1-48个条件按照顺序横着依次摆放到每行12道的10 ml管槽中,这样96个条件正好排放8行。 - 开始分装实验:
将仪器开关和封膜机开关打开,将控制软件打开,输入用户名Admin和密码tecan2021,打开Selection界面,选择分装程序:220Swissci_Plate96_3,如图2所示,点击绿色三角形箭头开始运行程序。接着会打开Runtime Controller界面,继续点击RUN开始分装,如图3所示。
程序是之前编辑好的,具体编辑的方法可以相关的说明书。 - 仪器初始化过程:
在运行程序之前仪器需要进行初始化,这一步是自动运行的,不需要进行操作,如图4和图5所示。
图2. 选择分装程序的Selection界面
图3. 运行之前的Runtime Controller界面
图4. 仪器开始初始化界面
图5. 仪器初始化过程界面
- 继续分装实验:
初始化之后,会自动跳到入程序运行的界面,如图6所示。接着会进入Set Variable界面,需要设置板子数量和分装的条件数量以及每个分装的体积,由于此次分装试剂盒的每个条件剩下的体积大概5 ml,所用的96孔晶体板的池液孔中大概需要加的体积是42微升,仪器进行分装的板位区可以放置12块板,所以我们板子数量设置为108块,如图7-9所示。接着仪器开始运行分装96个条件的池液到108块晶体板的池液孔中。程序是分装220块晶体板的,220板以内都可以,不能超过220块。
具体流程为:仪器的机械手臂先将舱中的晶体板从位置1从上到下取12块,依次放置在板位区,然后开始清洗8道加样钢针3遍,接着从提前摆放好的试剂盒10 ml管的第一列开始吸取42微升体积,加入到晶体板的第一列的池液孔中,依次加12列后,机械手臂将12块板依次放入到自动封膜机中进行封膜,然后在将板子放置回舱中,这就完成了第一批12块晶体板的分装;后面仪器重复上面的流程进行后面一批12块的板的分装,一共完成9次,就实现了108块晶体板的分装实验。
图6. 运行之中的Runtime Controller界面
图7. 设置板子数量的界面
图8. 设置分装条件数量的界面
图9. 设置分装体积的界面
- 结束实验:
实验结束后,分装好的108块晶体板已经封好膜放置回舱中,此时将舱门打开取出晶体板放置到4度恒温间中保存,用于后续的蛋白质晶体筛选实验。
失败经验
- 放置晶体板时,需要注意到板的方向,需要将第一列朝向舱门的方向放置,否则会导致加样的时候撞针和无法加样。
- 在分装之前,需要注意分装的池液体积,计算一下能够分装的板数,否则会导致后面板子分装不到足够的池液,浪费晶体板。
溶液配方
- Crystal ScreenTM和Crystal Screen 2TM试剂盒以及Additive Screen试剂盒:均是商业购买,开封后放置于4度恒温间储存,用于分装实验。
致谢
本文得到清华大学国家蛋白质研究技术中心的资助。
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王乐乐, 范仕龙. (2021). 结晶筛选池液的高通量分装制备. // 高通量筛选实验手册.
Bio-101: e1010878. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010878.
How to cite: Wang, L. L. and Fan, S. L. (2021). High Throughput Preparation of Crystallization Screening Pool Solution. // High-throughput Screening Protocol eBook.
Bio-101: e1010878. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010878.