高通量全自动蛋白质晶体优化池液制备方法
Automated Protein Crystal Optimisation With TTP Labtech’s Dragonfly Designer ^TM   

材料与试剂

1. 各种型号枪头 (200 µl, 1 ml)
2. 0.22 µm微孔滤器 (赛多利斯)
3. 注射器 (江苏治宇医疗器械有限公司)
4. 超纯水
5. 50 ml离心管 (康宁)
6. Magnesium chloride hexahydrate (SIGMA, catalog number: M2393-500G)
7. HEPES (VETEC, catalog number: V900479-500G)
8. Tris (VETEC, catalog number: V900483-5KG)
9. Polyethylene glycol 3,350 (SIGMA, catalog number: 88276-1KG)
10. DFC枪头：4150-07100 SPT
11. DFC池液槽：4150-07103 SPT
12. 96孔晶体板 (Swissci, catalog number: 3W96TUVP)
13. 48孔晶体板 (SWISSCI MRC Maxi 48孔板)
14. 1 M Hepes缓冲液 (见溶液配方)
15. 1 M Tris缓冲液 (见溶液配方)
16. 50% PEG3350 (见溶液配方)
17. 1 M Mgcl₂ (见溶液配方)
    

仪器设备

1. TTP Labtech’s dragonfly®
2. 震荡式混匀器 (德国海道夫，model: Titramax 101)
3. Mosquito蛋白结晶筛选仪 (TTP Factory, model: Mosquito)
4. 体式显微镜 (Nikon, model: SMZ18)
   

实验步骤

一、以一种信号通路蛋白晶体的优化方案为例来阐述dragonfly的用途 (Jenkins et al., 2014; Pitchai et al., 2016)。
该蛋白样品初筛获得的晶体生长条件有：

1. 0.2 M Magnesium chloride hexahydrate, 0.1 M HEPES pH 7.5, 25% w/v Polyethylene glycol 3,350.
2. 0.2 M Magnesium chloride hexahydrate, 0.1 M Tris pH 8.5, 25% w/v Polyethylene glycol 3,350.
   如图1所示，初筛晶体晶核多，晶体较小，无法进行捞取衍射和数据收集。需在晶体初筛条件的基础上，对晶体条件进一步优化，以得到高质量的蛋白单晶。
   
   
   图1.初筛获得的晶体图片
   

1. 仪器开机，打开控制软件Dragonfly Designer，完成仪器初始化。
2. 打开编辑软件Dragonfly Designer，软件将弹出设计窗口。首先，在图2红色区域“components”中添加优化组分，点击“add new”选项，依次填入晶体优化组分的名称，浓度，单位，PH值，池液类型，结果如图3所示。
   
   
   图2.编辑窗口
   
   
   图3.添加不同种类优化组分
   
   
3. 定义区间
   根据优化需求，需将板子划分为不同区域，优化组分可以添加在任意区域进行梯度优化。如图4所示，点击“add new”选项，下拉列表中选择预加载的区域，并在“region name”命名区域。本次实验选择“full plate”，“left-half”和“right-half”三个区域。区域可以随意更改和删除。
   
   
   图4.创建不同区域
   
   
4. 区域中添加优化组分，定义浓度梯度
   一旦所有区域都规划好，下一步向各个区域添加优化组分，定义组分优化的梯度方向和浓度。具体步骤：
   4.1

   选中区域“Left-Half”，添加要分配到该区域的组分：Hepes pH 7.5，Gradient保持不变，终浓度100 mM；Magnesium chloride hexahydrate，Gradient选择“Horizontal”横向梯度优化，浓度范围100-300 mM；
   4.2

   选中区域“Right-Half”，添加要分配到该区域的组分：Tris pH 8.5，Gradient保持不变，终浓度100 mM；Magnesium chloride hexahydrate，Gradient选择“Horizontal”横向梯度优化，浓度范围100-300 mM；
   4.3

   选中区域“full plate”，添加要分配到该区域的组分：Polyethylene glycol 3,350，Gradient选择“vertical”纵向梯度优化，浓度范围10%-30%；其中，定义浓度范围也可在该区域附近的编辑栏内输入所需梯度的最低浓度和最高浓度 (图5)。
   
   
   图5.选中某一个区域，选择优化组分，定义浓度梯度
   
   
5. PH梯度优化 (此部分根据优化判断是否需求，如图6所示，此处以Tris为例阐述PH优化方案编辑)
   5.1

   Components选择“pH SYSTEMS”模式；点击“IMPORT”选项，import会弹出一个用于导入PH系统的特定对话框，在“Buffer search”中输入缓冲液关键词 “TRIS”，下拉选项中选择所需buffer种类“TRIS”。选择完毕，“buffer stocks”会显示TRIS缓冲液所有可能的PH值；选择两个缓冲液梯度，一个最高PH值8.5，一个最低PH值7.5。这两种储存形成了“pH缓冲系统”。
   
   
   图6.“pH SYSTEMS”模式下，以tris为例，设置buffer缓冲范围
   
   
   5.2

   点击OK，将PH系统导入PH系统列表中。
   5.3

   创建好PH系统列表后，在“regions”下拉列表选择区域“full plate”。
   5.4

   选中区域“full plate”后，“gradients”选择PH模式，点击“add new”选项，确认PH System被选中。Gradient选择“vertical”纵向梯度优化，PH范围7.5 - 8.5 (选择的pH值不能超过pH系统的范围)，终浓度0.1 M。
6. 一旦所有的组分，区域和渐变都定义好了，切换到export选项卡。首先，“well volume”输入优化体积30 μl，输入最小分配体积，该值仅用于检测；如配发粘度极高的液体，如40% peg8000，则最小配发量应设置为1 μl，否则应保持在0.5 μl。点击“CALCULATE OPTIMISATION”，软件会自动计算出每种组分所需体积；
7. 最后，保存编辑好的文件。选择“dragonfly CSV”文件类型以适用dragonfly。文件还可以“PDF”文件和“Text”文件形式保存。

1. 打开控制软件Dragonfly，点击“OPEN”，打开提前保存好的CSV文件。“Plate Type”下拉列表选择所需板型Swiss 96孔板 (此处可任意选择提前定义好的板型，如图7所示)，“Well Volume”输入单孔所需池液体积30 μl。“Use Plate-mask”为板子上方加载的防护罩，可防止液体外溅，本实验选择不加。
   
   
   图7.选择板型
   
   
2. 进入“set up”界面；
   
   2.1

   安装枪头。蓝色突出部分为需要安装枪头的位置，每个枪头对应相应的池液类型和所需体积，按照位置逐一安装枪头 (由内到外)。仪器有五个插槽，每个插槽装有两个注射器。后排注射器从左至右对应位置A1-A5，前排注射器从左至右对应位置B1-B5。注射器是通过将它们滑动到机器前面的插槽来装载的。对于后排注射器，滑动注射器直到停止，然后向上推，并按下图所示的方向旋转90度 (图8)。如果是前排注射器，则向上推，同时将注射器推入槽中，当注射器推入孔中时，旋转如下 (图8)，安装完毕右上角绿色指示灯变为绿色.
   
   
   图8.安装枪头
   
   
   2.2

   A1-A3,B1-B2位置放入新的DFC池液槽，池液槽中加入对应体积的池液 (图9)；操作完毕，点击“Aspirate”按钮，吸取池液至枪头。
   
   
   图9.放置DFC池液槽
   
   
3. 将板子放置架子上，A1在左上角方向； 
4. 切换至Run界面，点击“Run”按钮，开始分液；
5. 池液分装完毕，切换至Set up界面，点击“Remove”，待枪头吐出剩余液体，机器回到初始状态，拔出枪头；
6. 关闭仪器；

第一次优化采用坐滴96孔板，96孔板优化的优势：可一次性配制筛选96种不同浓度梯度条件，缺点是液滴体积小，晶体体积相对较小，不易捞取；第二步采用48孔坐滴板进行优化，以获得质量更高更大的蛋白质晶体。具体优化步骤同上。

结果与分析

1. 96孔板用微孔板振动筛 (750 x g，1分钟) 混匀池液，用mosquito (200 nl蛋白 + 200 nl池液) 完成结晶重复。两天后观察液滴，对含有晶体的液滴拍照；
2. 48孔板用震荡混匀器混匀池液，用mosquito (500 nl蛋白 + 500 nl池液) 完成结晶重复。三天后观察液滴，对含有晶体的液滴拍照；
   
   
   图10.优化获得的晶体图片
   

溶液配方

1. 1 M Hepes缓冲液
   6.057 g粉末溶于50 ml ddH₂O，PH调制7.5，0.22 µM滤器过滤除菌，存放4 °C
2. 1 M Tris缓冲液
   11.9 g粉末溶于50 ml ddH₂O，PH调制8.5，0.22 µM滤器过滤除菌，存放4 °C
3. 50% PEG3350
   25 g粉末溶于50 ml ddH₂O，0.22 µM滤器过滤除菌，存放4 °C
4. 1 M Mgcl₂
   4.76 g粉末溶于50 ml ddH₂O，0.22 µM滤器过滤除菌，存放4 °C
   

致谢

本文得到清华大学国家蛋白质研究技术中心的资助。

参考文献

1. Jenkins and Cochrane,(2014). Automated protein crystal optimisation with TTP Labtech's dragonfly. Acta Crystallogr A 70, C1743-C1743.
2. Pitchai et al.,(2016). Characterization of the NTPR and BD1 interacting domains of the human PICH-BEND3 complex. Acta Crystallogr F 72, 646-651.