高通量原位Ｘ射线衍射技术鉴定蛋白质晶体
High Throughput Identifying of Protein Crystals by In-situ X-ray Diffraction Technique   

材料与试剂

1. 96孔晶体板(Swissci, catalog number: 3W96TUVP)
2. 溶菌酶(Macklin, catalog number: L6051-25g)
3. Crystal Screen™试剂盒(Hampton Research, catalog number: HR2-110)
4. Crystal Screen 2™试剂盒(Hampton Research, catalog number: HR2-112)
   

仪器设备

1. 原位蛋白晶体衍射仪(Rigaku, 型号: PX Scanner)
2. Mosquito蛋白结晶筛选仪(TTP Factory, 型号: Mosquito)
3. 自动封膜机(BRANDEL, 型号: RS-232)
   

软件

1. CrystalEyes

实验步骤

1. 观察的样品以筛选溶菌酶蛋白晶体的96孔晶体板为例：
   使用Mosquito蛋白结晶筛选仪在Swissci 的96孔晶体板来筛选溶菌酶蛋白晶体，其中96孔晶体板的池液孔中添加了Crystal Screen™试剂盒和Crystal Screen 2™试剂盒的前1-48个条件，一共96个条件。
2. 将晶体板放入仪器：
   点击电脑桌面上的“CrystalEyes”图标，登录提前设置好的用户名和密码，打开软件。点击软件窗口最下方的“Eject”，在仪器的主机部分的门会打开，放入要测试的晶体板，点击“Insert”（CrystalEyes窗口的最下方），会打开一个窗口。在Plate name 中输入晶体板的名称，在Plate type 中选择相对应的的Manufacturer和Pruduct ID，点击相机标志可以看到左侧中的出现的晶体板，来确定Manufacturer和Pruduct ID是否选择正确。点击“Insert”（Insert Plate窗口中的最下方），晶体板即被仪器自动拉入仪器的仓中。
3. 晶体板的可见光成像：
   在Plate View 中选择需要进行成像处理的Well和Drop，左键单击可以选中Well，也可右键直接选择Select All（如图1所示），选中后Well会有显示出被选中的框（如图2所示）。选中Well之后，右键选择Uptdate Sel中的D1，观察添加了溶菌酶溶液的孔（如图3所示），仪器将一次性高通量自动化拍摄晶体板中96孔的图片，拍摄列表如图4所示。如果晶体板的其他Drop中也有蛋白样品，那么可以选择Full。
4. 原位X射线衍射：
   经过上面的步骤，从结果图片中找到一个有晶体的Drop，在图片上将鼠标移到晶体的位置，右键选择Long: 20 min,6×0.5 deg（如图5所示），此项曝光时间20 min，可以鉴定出晶体是否为蛋白晶体，并拍出蛋白晶体的衍射点。
   
   
   图1. Plate View 中选择需要成像的Well
   
   
   图2. 选中的Well显示被选中的框
   
   
   图3. Plate View 中选择需要成像的Drop
   
   
   图4. 拍摄列表
   
   
   图5.原位对选中晶体进行20 min X射线衍射
   
   
5. 衍射图片的处理：
   步骤4得到下面的衍射图后点击软件左侧图标可以得到下图左下侧小窗口，可以调节背景亮度方便看衍射点，也可以添加分辨率环，如图6(Agilent Technologies,2012)所示。
   
   
   图6. 调节背景亮度和添加分辨率环
   
   
6. 取出板子：
   点击“Eject”取出板子，结束实验，如果要继续观察实验，换另一个板子，重复步骤2、3、4、5。
   

结果与分析

1. 如图7所示，左边是晶体图片，右边是选中的晶体进行衍射后的图片，对应的晶体板的孔是C5，对应的生长条件是0.1 M HEPES sodium (pH 7.5), 0.8 M Potassium sodium tartrate tetrahydrate，原位晶体衍射获得的分辨率为2.9埃，此晶体为蛋白质晶体。
2. 如图8所示，左边是晶体图片，右边是选中的晶体进行衍射后的图片，对应的晶体板的孔是C11，对应的生长条件是0.1 M HEPES sodium (pH 7.5), 0.8 M Sodium phosphate monobasic monohydrate, 0.8 M Potassium phosphate monobasic，原位晶体衍射获得的分辨率约为10埃左右，此晶体为蛋白质晶体。
3. 如图9所示，左边是晶体图片，右边是选中的晶体进行衍射后的图片，对应的晶体板的孔是D5，对应的生长条件是0.1 M HEPES sodium (pH 7.5), 10% v/v 2-Propanol, 20% w/v Polyethylene glycol 4,000，原位晶体衍射获得的分辨率约为3.9埃左右，此晶体为蛋白质晶体。
   
   
   图7. C5孔选中的晶体图片和衍射图片
   
   
   图8. C11孔选中的晶体图片和衍射图片
   
   
   图9. D5孔选中的晶体图片和衍射图片
   

失败经验

1. 蛋白晶体和盐晶的衍射图区分:
   
   
   图10. 蛋白晶体和盐晶的衍射图对比
   
   如图10中的右图所示的盐晶的衍射点在高分辨率区较强，低分辨率区几乎没衍射点，而左图中的蛋白晶体的衍射点刚好相反，两者有明显的区别，通过这个规律可以区分鉴定蛋白质晶体和盐晶。
   

致谢

本文得到清华大学国家蛋白质研究技术中心的资助。

参考文献

1. Agilent Technologies XRD Products. Crystal Eyes User Manual (Software for PXScanner protein crystal scanning system). Version 2.3, February 2012.