蛋白质晶体高通量筛选制备方法
High Throughput Screening Method for Preparation of Protein Crystals   

材料与试剂

1. 96孔晶体板 (Swissci，catalog number：3W96TUVP)
2. 96孔悬滴池液板 (TTP Factory，catalog number：4150-05701 SPT)
3. 96孔悬盖板 (TTP Factory，catalog number：4150-05600 viewdrop)
4. 1.5 ml EP管 (ExCellBio，catalog number：CS015-0041)
5. 50 ml离心管 (Corning，catalog number：430829)
6. 针卷 (TTP Factory，catalog number：4150-03020 SPT) 
7. 蛋白条 (TTP Factory，catalog number：4150-03100 SPT)
8. 悬滴池液板适配器 (TTP Factory，catalog number：3019-05012 SPT)
9. 悬滴盖板适配器 (TTP Factory，catalog number：3019-05101 SPT)
10. 溶菌酶 (Macklin，catalog number：L6051-25g)
11. Crystal Screen™试剂盒 (Hampton Research，catalog number：HR2-110)
12. Crystal Screen 2™试剂盒 (Hampton Research，catalog number：HR2-112)
13. Additive Screen试剂盒 (Hampton Research，catalog number：HR2-428)
14. 超纯水 (经过超纯水仪过滤后的去离子水)
15. 溶菌酶溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. Mosquito蛋白结晶筛选仪 (TTP Factory，型号：Mosquito)
2. 4 °C高速离心机 (Thermo Scientific，型号：Sorvall Legend Micro 17)
3. 体式显微镜 (Nikon，型号：SMZ18)
4. 1 ml移液器 (Thermo Scientific，型号：Finnpipette F1)
   
5. 20 µl移液器 (Thermo Scientific，型号：Finnpipette F1)
6. 全自动液体处理工作站 (Tecan，型号：Freedom EVO)
7. 自动封膜机 (BRANDEL，型号：RS-232)
   

实验步骤

一、试剂盒分装制备
提前使用全自动液体处理工作站将结晶筛选试剂盒中的条件分装到Swissci的96-3坐滴板和TTP的96孔悬滴池液板中，以供筛选使用。通常商业化的试剂盒约有二三十种，每种约96个条件，通过Mosquito可以快速高效的实现约三千个条件的高通量筛选，本文中实验以Crystal Screen™ 和Crystal Screen 2™试剂盒以及Additive Screen试剂盒为例。

二、Mosquito的高通量筛选程序编辑
首先将仪器先开机之后，再打开控制软件，进行初始化。通过程序编辑，Mosquito可以一次性实现96~288个条件的高通量筛选。

1. 采用Swissci的96孔坐滴板进行一种蛋白结晶筛选的Protocol：
   按照图1所示，第一步移液方式选择Aliquot，从position 1中蛋白条适配器1号蛋白条中吸取样品，依次分装到position 3中96孔的坐滴板的1到12列的3号孔中。第一步换针的方式选择Between transfer，表示这一步过程中将不换针，进行下一步移液的时候再换针，也可以选择Never，结果都是一样的。因为是一个蛋白样品，选择此换针方式可以节省针数。Between transfer和Never的区别主要在于当前一步和下一步是否相同的移液方式，如果相同，选Never时将不换针；选Between transfer时，不管是否相同都换针。而加样体积可以根据自己蛋白样品量的多少来确定，此例中选择200 nL体积。
   第二步移液方式选择copy，从position 3中96孔板的1号孔中吸取一列池液加样到3号孔中，依次每列都如此加样。第二步换针的方式选择Always，每次吸取的池液都是不同的，必须每次加样都换针。
   
   
   图1. 采用Swissci 96-3板进行一种蛋白结晶筛选的Protocol
   
   
2. 采用96孔悬滴板进行一种蛋白结晶筛选的Protocol：
   悬滴法与坐滴法的主要区别在于移液方式的选择上，以TTP的96孔悬滴板为例，编辑的Protocol如图2所示。第一步选择Aliquot正向分装，也可以选择Reverse Aliquot反向分装，反向的要比正向总时间上稍慢几秒。从Position 2中5 µl规格蛋白条吸取样品加到Position 3中96孔悬滴盖板的1到12列。第二步将坐滴法中的copy方式改成mirror，从Position 1中96孔板的第一列吸取池液加在Position 3中96孔悬滴盖板的最后一列，依次类推镜像加样，总消耗针数为104根。
   
   
   图2. 采用96孔悬滴板进行一种蛋白结晶筛选的Protocol
   
   
3. 采用additive方法进行蛋白结晶筛选的程序编辑：
   采用购买的96个条件的添加剂试剂盒，预先将添加剂加在Mosquito软件系统中定义过的96孔板里，比如TTP的96孔池液板，那么就可以通过编辑相应的Protocol来实现自动化的添加剂实验方法的应用了。
   以Swissci的坐滴板为例，每板点1个蛋白样品，同时还要添加96个条件的10×的添加剂，那么可以按照图3在Setup界面下方所示来设置板型和蛋白条型号(同时图3上方还标记出了蛋白条中蛋白样品位置编号以及晶体板的样品微孔的位置编号，这些位置编号都需要在Protocol界面中设置)。
   
   
   图3. Setup界面设置板型和蛋白条型号
   
   按照图4-7来编辑Protocol。具体为：第一步选择Aliquot，从Position 2中的5 µl规格的蛋白条中吸取200 nl样品加到Position 3中坐滴板每一列的2号微孔中，如图4所示。
   
   
   图4. Protocol中第一步加蛋白样品
   
   第二步选择Multi-Aspirate，从position 1中的96孔池液板里吸取第一列40 nl的添加剂不加样，接着进行第三步copy从Position 3中坐滴板第一列的1号微孔中继续吸取200 nl池液，一起加样到Position 3中坐滴板第一列的2号微孔中，从左到右依次加样1到12列，完成添加剂的实验，这两步消耗针数96根，总消耗针数为104根，如图5-6所示。
   
   
   图5. Protocol中第二步吸取添加剂溶液
   
   
   图6. Protocol中第三步吸取池液加样到晶体板2号微孔中
   
   
   

三、Mosquito的高通量筛选程序运行：
首先将仪器后方的开关打开，打开电脑上的控制软件，并进行初始化操作。

1. 采用Swissci的96孔坐滴板进行一种蛋白结晶筛选的Protocol运行：
   在控制软件中打开设置好的程序，将移液器量程设置成5 µl，取5 µl规格的蛋白条放置到Mosquito的position 1中蛋白条适配器的1编号位置上，蛋白条的每个孔均添加上溶菌酶蛋白溶液。将添加了Crystal Screen™和Crystal Screen2™两盒试剂盒中1-48个条件的Swissci的96孔座滴板，放置到Mosquito的position 3上。运行程序结束后，将板子放到自动封膜机上封膜，并放置在16度恒温间生长。
2. 采用96孔悬滴板进行一种蛋白结晶筛选的Protocol运行：
   在控制软件中打开设置好的程序，将移液器量程设置成5 µl，取5 µl规格的蛋白条放置到Mosquito的position 2上，蛋白条的每个孔均添加上溶菌酶蛋白溶液。将添加了Crystal Screen™和Crystal Screen2™两盒试剂盒中1-48个条件的TTP Factory的96孔悬滴池液板，放置到Mosquito的position 1上，将TTP Factory的96孔悬滴盖板，放置到Mosquito的position3上。运行程序结束之后使用专用的适配器将加完样品的96孔悬滴盖板覆盖到TTP的96孔池液板上，完成悬滴实验，将晶体板放置在16 °C恒温间生长。
3. 采用additive方法进行蛋白结晶筛选的程序运行：
   在控制软件中打开设置好的程序，将移液器量程设置成5 µl，取5 µl规格的蛋白条放置到Mosquito的position 2上，蛋白条的每个孔均添加上溶菌酶蛋白溶液。将添加了Additive Screen试剂盒中1-96个条件的TTP Factory的96孔悬滴池液板，放置到Mosquito的position 1上，将Swissci的96孔座滴板放置到Mosquito的position 3上。运行程序结束之后将板子放到自动封膜机上封膜，并放置在16 °C恒温间生长。

结果与分析

实验结果选取了采用Swissci的96孔坐滴板进行溶菌酶结晶筛选结果作为代表，使用晶体观察设备拍摄了筛选出来的晶体图片，图片结果如下图7所示，这些结果可供后续进行蛋白晶体的鉴定和衍射实验，以及数据收集和结构解析实验。对应的条件根据试剂盒的说明书如下表格1所示，可为后续晶体重复和优化做参考。


图7. 筛选出来的晶体图片

表1. 筛选出晶体对应的生长条件

注意事项

1. 实验步骤三中1的坐滴法点一个蛋白样品的实验还可以扩展如下：
   1.1

   采用96孔坐滴板进行一种蛋白3种不同浓度的结晶筛选的Protocol：
   因为蛋白浓度直接影响着晶体筛选过程中晶体的生长，是需要提前确定的一个关键条件，这时就需要一种蛋白设置2-3种浓度来结晶筛选。
   以Swissci的板型为例，如果每板点同一个蛋白3个不同浓度的样品，那么可以按照图8来编辑坐滴法的Protocol。第一步到第三步依次选择3种不同浓度的蛋白样品的Aliquot加样方式，先后顺序为蛋白浓度从低到高依次加样，分别从position 1中的蛋白条适配器第1、2、3列蛋白条依次加样到position 3中96孔座滴板的2、3、4号孔中 。因为同一种蛋白，换针的方式都选择Never。第四步到第六步选择copy的加样方式，分别从position 3中96孔座滴板的1号孔中吸取池液依次加样到2，3，4孔中。因为同一种蛋白，换针的方式选择Multi-dispence，那么每列针会同时吸够3个Drop所需的池液分3次加在3个Drop中，因此总消耗针数还是104根。
   
   
   图8. 采用Swissci 96-3板进行3种浓度的一种蛋白结晶筛选的Protocol
   
   
   1.2

   采用96孔坐滴板进行3种蛋白结晶筛选的Protocol：
   以Swissci的板型为例，如果每板点三个不同的蛋白样品，那么可以按照图I来编辑坐滴法的Protocol。由于都是不同的蛋白样品，所以可以参照1.1.1的protocol，依次运行3次，依次加样在96孔坐滴板的2、3、4孔中即可。这种情况，加蛋白和加池液的先后顺序不会影响消耗的针数，因此总消耗针数为312根。而每一个都是先加蛋白再加池液，可以避免液滴的蒸发影响到蛋白的浓度。
   
   
   图9. 采用Swissci 96-3板进行3种蛋白结晶筛选的Protocol
   
   
2. 实验步骤三中2的悬滴法点一个蛋白样品的实验还可以扩展如下：
   采用96孔悬滴板进行2种蛋白结晶筛选的Protocol：
   由于设备的板位有限，所以悬滴法比较适用于点一个蛋白，如果想要点两个以上的蛋白，则需要在点完一个蛋白之后，手动更换Position 2中蛋白条及样品，再进行第2个蛋白的加样。若每个孔点的样品数量在2个以上，样品的体积也需要减少，否则液滴容易聚合到一起。
   以在TTP 96孔悬滴板中进行2种蛋白样品加样实验为例，编辑的Protocol如图10所示。首先Position 3中96孔悬滴盖板要选择有2个孔位的，编号分别为2号和3号。参照1.3.1中的程序，第一步和第二步是加一个蛋白样品和池液到Position 3中96孔悬滴盖板中的2号孔中。第三步添加一项Pause，这时程序会自动停止，弹出一个界面，所有板位会回到最初的位置，这时可以更换蛋白条和样品，换完之后点击界面中的resume，继续开始第三步和第四步，加第二个蛋白样品和池液到Position 3中96孔悬滴盖板中的3号孔中，完成所有加样，总消耗针数208根。结束之后使用专用的适配器将加完样品的96孔悬滴盖板覆盖到TTP的96孔池液板上，完成悬滴实验。
   
   
   图10. 采用96孔悬滴板进行2种蛋白结晶筛选的Protocol
   
   
   
3. 其他各种情况的Protocol扩展：
   如果使用的晶体板的板型有变化，那么可以在setup页面更改成相应的板型即可。同样的，用户可以根据自己的实验需求来编辑适合自己的Protocol，一般需要变化的内容包括加样点的数量，换针方式，加样的体积等等。对于体积的设定，由于加样针一次最大可以吸取1.2 µl，如果蛋白加样体积设置为100 nl，那么一次吸取之后可以分装一整板，如果超过100 nl，那么会吸取两次才能分装一整板。添加剂方法的程序编辑也可以根据自身情况来如此进行扩展。
4. 扩展的Protocol 的运行：
   根据自己的实验需求打开相应的程序后，将移液器量程设置成5 µl，根据程序取5 µl规格的蛋白条放置到Mosquito的蛋白条适配器的相应编号位置上，蛋白条的每个孔均添加上蛋白溶液。并将所有板子房子正确的位置上，运行程序结束后，将板子放到自动封膜机上封膜，并放置在恒温间生长，一般3天、7天后使用显微镜观察晶体筛选的结果。
   

失败经验

1. 确定合适的蛋白浓度：
   蛋白浓度直接影响着晶体筛选过程中晶体的生长，是需要提前确定的一个关键条件，所以在进行大量的条件筛选之前，建议先选择一到两种经典的筛选试剂盒进行试验，比如Crystalscreen、PEGRx等，选取2种以上的浓度，来确认最终合适的浓度。通过观察整板蛋白溶液和筛选液混合后的状态，如果整板超过80%以上都是蛋白沉淀状态，如下图11所示，说明蛋白浓度可能偏高，需要降低一些，反之亦然。确定合适的蛋白浓度之后，我们就可以开始进行大量的条件筛选了。
   
   
   图11.蛋白的一种沉淀状态
   
   
2. 确定蛋白溶液的稳定性：
   除了蛋白浓度这一因素，蛋白质在溶液中的聚合状态和稳定性也会影响蛋白质的结晶，如果某种蛋白在经过大量条件筛选之后依然没有筛选出结晶条件，那么可以尝试通过平台的多参数蛋白质稳定性检测仪UNcle或者X射线小角散射仪来检测蛋白质在溶液中的状态，筛选出合适的buffer，金属离子添加剂或者抑制剂等，保证蛋白质在溶液中稳定性均一性良好，然后再进行结晶筛选。
3. 使用加湿器的必要性：
   在北方的干燥气候条件下，通常都需要用到加湿器，尤其是在点样体积小于20 ml的时候，所以在进行方法编程时一般需要在前面加上Humidity Control这一项，或者在运行程序之前点击Humidfy，加湿了一段时间之后再运行。以在Swissci的96孔坐滴板中进行一个蛋白样品加样的Protocol为例，添加Humidity Control后的Protocol，如图L所示。Humidity Control这一步中，可以设置具体加湿的时间，以及选择high、medium、low三种湿度标准。其中high的湿度范围在65-75%，medium湿度范围在50-65%，low湿度范围在40-50%。通常选择medium就可以。
   
   
   图12. 添加Humidity Control项的Protocol
   
   
4. 选择合适的蛋白条：
   目前蛋白条的规格有两种，高体积5 µl和低体积2 µl的，两种体积的凹槽的底面积不同导致吸取的精确度也不同。一般蛋白溶液建议使用5 µl的蛋白条，一方面吸取的体积较大约50~1200 nl，另一方面在进行大量筛选时，可以减少补充蛋白溶液的次数。而在进行Seeding实验或者添加剂实验的时候，建议使用2 µl的蛋白条加Seed和添加剂，因为一般所需体积较小约20~25 nl，针可以更精确地吸取小体积液体。在蛋白条的每个孔均添加上样品时，使用移液器时需要采用第一档位，防止产生气泡，避免加样针在吸取样品的时候吸空，从而避免加样体积不准确或者加不上样品。
   

溶液配方

1. 溶菌酶溶液：
   取溶菌酶样品17 mg，溶解到1 ml的超纯水中，轻微震荡5 min达到完全溶解后，放置到冰上1小时后，使用4 °C高速离心机，12000 × g/min转速离心1 min后，放置冰上，以供筛选使用。
2. Crystal Screen™ 和Crystal Screen 2™试剂盒以及Additive Screen试剂盒：均是商业购买，开封后放置于4 °C恒温间储存，在16 °C温度下进行分装后，用于晶体筛选实验。
   

致谢

本文得到清华大学国家蛋白质研究技术中心的资助。