高内涵成像分析系统用于类器官蛋白表达分析
Using high-content Screening Analysis System to Analyse the Expression and Distribution of Certain Protein in Stomach Organoid   

材料与试剂

1. 96孔板 (PerkinElmer，96 CellCarrier ultra)
2. 人源组织保存液 (京创和益, catalog number: CH-0001A)
3. 人胃类器官培养基 (京创和益, catalog number: CH-0302A)
4. Advanced DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 12634010)
5. HEPES (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 15630080)
6. UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 15575020)
7. Penicillin-Streptomycin (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 15140122)
8. Primocin (InvivoGen, catalog number: ant-pm-1)
9. GlutaMAX Supplement (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 35050061)
10. Matrigel BD (Biosciences, catalog number: 356231)
11. B-27 Supplement (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 17504001)
12. N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-Aldrich, catalog number: A9165)
13. [Leu15]-Gastrin I human (Sigma-Aldrich, catalog number: G9145)
14. Recombinant Human EGF (R&D, catalog number: 236-EG-200)
15. Recombinant Human FGF10 (R&D, catalog number: 345-FG-25)
16. A83-01 (Tocris, catalog number: 2939/10)
17. Y-27632 (Tocris, catalog number: 1254/10
18. Wnt3A conditioned medium (京创和益, catalog number: CH-M001A)
19. R-spondin1 conditioned medium (京创和益, catalog number: CH-M002A)
20. Noggin conditioned medium (京创和益, catalog number: CH-M003A)
21. Alexa Fluor^TM 488 Phalloidin (Thermo Fisher Scientific, catalog number: A12379)
22. Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, catalog number: 14533)
    

仪器设备

1. 细胞培养箱 (Eppendorf, model: C170i)
2. 离心机 (Eppendorf, model: 5810R)
   

软件

1. Operetta CLS高内涵成像分析系统 (PerkinElmer, USA)
2. Harmony分析软件 (PerkinElmer, USA)
   

实验步骤

一、人源胃类器官的培养
手术切除人正常胃样品保存于组织储存液中，EDTA法分离人源胃干细胞 (具体方法此处不再赘述，可通过邮箱交流)，用Matrigel重悬后 (每孔40 μL)，种植于24孔板 (低吸附) 中，放置于细胞培养箱中，待15 min后，Matrigel凝固，加入500 μL人源胃类器官培养基。细胞培养箱中培养4-6天，期间换液一次。
人源胃类器官培养基为本公司产品，可邮箱询价购买，或用以下试剂部分替代：Advanced DMEM/F12, 1x GlutaMax, 1x HEPES, 1x P/S, 50% Wnt3A conditioned medium, 10% R-spondin1 conditioned medium, 10% Noggin conditioned medium, 1x B27, 50 ng/mL EGF, 200 ng/mL FGF10, 1 mM N-Acetylcystenine, 1 nM Gastrin, 2 μM A83-01, 10 μM Y-27632 and 1 μg/μL primocin

二、人源胃类器官免疫荧光染色

1. 培养结束后，用PBS轻柔的重悬清洗类器官，加入4% paraformaldehyde (PFA)室温固定1 h。
2. PBS轻柔清洗类器官4次，200 × g室温离心2 min收集类器官，0.5% Triton X100室温孵育30 min以透膜。
3. PBS轻柔清洗类器官4次，200 × g室温离心2 min收集类器官，加入PBS稀释的Phalloidin (F-actin蛋白荧光染料) 和Hoechst 33342 (细胞核荧光染料) (终浓度为试剂说明书推荐工作浓度)，室温孵育1 h。
4. PBS轻柔清洗类器官4次，200 × g室温离心2 min收集类器官。

1. 将类器官转移到96孔板 (PerkinElmer，96 CellCarrier ultra) 中，每个孔中放置5-20个类器官。
2. 高内涵成像：打开高内涵，打开Harmony软件，首先设置5倍空气镜成像条件，对整孔进行成像，non-confocal模式，通道为Alex 405 + Alex 488 + brightfield，每个视野之间设置5% overlap，保存5倍成像条件并运行一遍；成像后，在Image analysis中编写分析算法，使得高内涵分析软件可以根据5倍成像结果找到类器官所在位置，具体算法为：Input Image (create global image，individual plane，FFC none)——Find Image Region (Alex 405 (global))——Calculate Morphology Properties (Area + Roundness)——select population (Area > 100 & Area < 8000 & Roundness > 0.8)——Determine Well Layout (Rescan 20x)——Define Results，保存该算法，将该算法与5倍成像条件关联，重新保存5倍成像条件；而后设置20倍水浸式物镜成像条件，confocal模式，通道为Alex 405 + Alex 488 + brightfield，多层成像(-10 — +488 μm，每隔2 μm一层，共250层)，保存20倍成像条件。设置完成后，采用precision scan拍摄模式，载入5倍成像条件和20倍成像条件，对样品进行先后两次成像，最终获得Alex 405 + Alex 488 + brightfield三个通道下，250层共聚焦对多个类器官成像的图片结果。

1. 在Harmony软件中，选择Image analysis界面，Input Image模块中，选择“3D analysis”，对类器官进行立体重构
2. 使用Find Image Region模块找到类器官
3. 使用Select Region模块分别识别类器官内层和外层
4. 使用Calculate Intensity Properties模块分布计算内层和外层的Alex 488通道荧光强度平均值和总和值 (mean & sum)
5. 在Define Results模块选择要导出的整孔与单个类器官分析结果
6. 保存分析程序，在Evaluation界面运行该分析程序
   
   
   图1. 高内涵结果分析流程

结果与分析

1. 成像结果（图2）：
   
   
   图2. 人胃类器官高内涵成像结果，左：最大亮度投影视图，右：3D重构视图
   
   
2. 单个类器官分析结果见图3，由此可知，在这个类器官中，F-actin蛋白的分布，即绿色荧光信号 (Alex 488通道) 的荧光强度，内层要显著高于外层，这与预期与报道一致，即胃类器官生长过程中需要维持F-actin蛋白的极性分布：
   
   
   图3. 人胃类器官分层分析F-actin分布情况及结果
   
   
3. 整孔分析数据可通过Harmony软件作图，得出以下结果图，由此可知内层的平均荧光强度 (mean) 显著高于外层，但内层的总荧光强度 (sum) 显著低于外层，这主要是由于外层体积要比内层大很多导致的，该结果也与预期相符（图4）：
   
   
   图4. 人胃类器官F-actin极性分布统计作图结果
   

致谢

感谢中科院过程所生化工程国家重点实验室PerkinElmer转化医学工程共建实验室提供高内涵成像分析系统及PerkinElmer技术人员李想的支持和辅助。

参考文献

1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. (2014). Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science 345(6194): 1247125.
2. Sato, T., Vries, R. G. (2009). Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 459(7244): 262-5.