长爪沙鼠精子冷冻保存
Sperm Cryopreservation of Mongolian Gerbil   

材料与试剂

1. 麦管（Planer, catalog number: FCBS010287）
2. EP管（Eppendorf）
3. 矿物油（sigma, catalog number: M8410）
4. 精子冻存液（CPA, catalog number: KYD-001-EX）
5. HTF（CPA, catalog number: R18S3）
   

仪器设备

1. 35 mm培养皿(Nunc-153066)
2. 计时器（kubler）
3. 浮漂（自行制备）
4. 手术器械购置上海医疗器械（集团）有限公司, 手术剪(Y00030, 10cm直尖头），解剖剪(JD1050，10cm，直有钩)，眼科镊(JD1070，10cm直有钩)，显微镊（WA3210），显微剪（WA1030）
   

实验步骤

1. 实验前准备
   ①标记好麦管编号。
   ②制作冻存管套，打好孔。标明麦管编号，长爪沙鼠品系，实验室PI，冻存日期和实验者。
   ③提前将浮漂和冻存管套放入液氮中进行预冷。
   ④做120 μL精子冻存剂(CPA)高滴。先用冻存保护剂做60 μL，覆盖少量矿物油后再加入60 μL，再用矿物油进行完全覆盖。
   ⑤另做两个30 μL的CPA洗滴，用于在显微镜下清洗附睾(去除脂肪和血)
   ⑥取2 ml左右HTF，用作于麦管的填充剂。
   
2. 实验步骤
   ①挑选适龄雄鼠，对雄鼠安死术。长爪沙鼠的雄鼠一般选择10 w以上，最佳12～18 w。
   ②手术分离附睾，置常温的矿物油里清洗2遍；之后取出附睾，在吸水纸上去除上面肉眼可见的脂肪和血。
   ③将附睾放入30 μL CPA溶液的洗滴中，将附睾上残存的脂肪和血液完全清理干净。将附睾放入被矿物油覆盖的120 μL CPA做成的液滴中，用显微剪剪3下，让精子自然游出。
   ④常温下放在显微镜台面上3分钟，每分钟都要轻轻摇几下培养皿，使附睾中的精子可以尽量扩散到CPA中。用10μL移液器吸取精液，做成10μL的精液滴。
   ⑤接下来准备冻存管，用三通阀分别吸取150 μL HTF，30 μL空气，10 μL精子，然后吸取空气直至上端HTF溶液吸到麦管的过滤棉塞处。
   ⑥麦管两端用封口机进行封口。将封好口的麦管放入浮漂内，预冷10 min。
   ⑦10 min后将麦管放入液氮中的冻存管套里。
   

致谢

感谢国家自然科学基金项目（Nos. 31572341, 31572347, 31772545, 31572348）和国家科技支撑计划项目（No. 2015BAI09B00）的资助。

参考文献

1. Low, B. E., Taft, R. A. and Wiles, M. V. (2016). Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery of Genetically Modified Mice. Methods Mol Biol 1438: 55-66.