长爪沙鼠胚胎冷冻保存与复苏
Embryo Cryopreservation and Recovery in Mongolian Gerbils   

材料与试剂

1. 医用缝合线（上海浦东金环医疗用品股份有限公司，catalog number: 11U0907）
2. 麻醉剂Avertin（sigma–Aldrich, catalog number: T4,840-2）
   
3. 人绒毛膜促性腺激素（hCG）（宁波第二激素厂, catalog number: 140322）
4. 孕马血清促性腺激素（PMSG）（宁波第二激素厂, catalog number: 140324）
5. 矿物油（sigma–Aldrich, catalog number: M8410）
6. M2培养（sigma–Aldrich, catalog number: M7167）
7. DMSO（sigma–Aldrich, catalog number: D2650）
8. 1 M DMSO（自行配制，参见参考文献）
9. 冻存液DAP213（自行配制，参见参考文献）
   
10. DPBS缓冲液（GIBCO, catalog number: C14190500BT）
11. KSOM (Merck Millipore, catalog number: MR-107-D)
12. sucrose (Merck Millipore, catalog number: 1.00892.9050)
    

仪器设备

1. CO₂培养箱(Thermo, Herocell 180)
2. 手术器械购置上海医疗器械（集团）有限公司，手术剪(Y00030, 10cm直尖头），解剖剪(JD1050，10cm，直有钩)，眼科镊(JD1070，10cm直有钩)，显微镊（WA3210），显微剪（WA1030）
3. 体视显微镜(Motic SN-168)
   

实验步骤

1. 超数排卵与合笼交配
   取6周龄雌性长爪沙鼠，每只动物腹腔注射PMSG 10 IU，70小时后腹腔注射hCG 10 IU，之后与10周龄以上雄性长爪沙鼠合笼(图1)，使用露底的笼盒以便检查阴道栓。
   
   
   图1. 检查阴道栓使用的露底笼盒
   
   合笼第二天在检查到阴道栓（长爪沙鼠阴道栓呈乳白色，外形及大小类似大米，但两端稍尖），之后将雌性动物与雄性动物分开饲养，第三天早上对雌性长爪沙鼠实施安死术，使用DPBS溶液冲出输卵管伞部2-cell胚胎，进行胚胎冻存。
   
2. 2-cell期胚胎冷冻试剂准备：（根据胚胎数量，决定使用每种试剂的量）
   ①DMSO（常温），DAP213A，DAP213B冰上预冷1小时以上。
   ②实验过程使用的EP管需要冰上预冷；冻存管常温。
   ③DAP213（DAPA：DAPB=1：1）使用前配制混匀。
   ④在冻存管标记品系信息（一定清晰准确，以防品系混淆）。
   
3. 洗卵和冻存：
   在培养皿中做四个1M的DMSO液滴（100 μL/液滴），其中一个液滴用于清洗胚胎，其他的液滴则用于放置清洗后准备冷冻的胚胎。用口吸管将一组胚胎移入其中的一个液滴内，以清洗其培养液或胚胎采集溶液等，然后均匀分配胚胎至另外三个液滴中。例如，采集了150个胚胎，先将其移入一个DMSO液滴中，然后按照每组50个分别移入另外三个液滴中。用移液器调整移液量至5μL后吸取50枚胚胎，移入冷冻管内，然后将冷冻管放入冰上，在0℃状态平衡5分钟后，加入预先放置在0℃冰上平衡的DAP213溶液45μL，盖子拧紧后回拧半圈，在冰上再平衡5分钟，取出平衡后的冷冻管，迅速装入冷冻管固定夹后，直接浸入液氮中。
   
4. 胚胎复苏
   准备预热的KSOM培养滴，80 μL/滴。
   从液氮中取出冻存管，倒掉液氮，室温放置30 s，加入900 μL sucrose，轻轻吹打10次左右，吸出试剂和胚胎；再吸取剩余的sucrose加入冻存管，吸出遗漏的胚胎。
   

致谢

感谢国家自然科学基金项目（Nos. 31572341, 31572347, 31772545, 31572348）、国家科技支撑计划项目（No.2015BAI09B00）和和“十三五”时期北京市属高校高水平教师队伍建设支持计划(IDHT20170516)的资助。

参考文献

1. 郭红刚, 卢领群, 周生来, 戴方伟, 李巍, 李长龙, 陈振文, 萨晓婴(2014). 乙二醇玻璃化冷冻液二步法对长爪沙鼠2-细胞胚胎的冷冻保存. 实验动物科学 31: 28~31，64~65
2. 梁洋,杜文敬,王春生,朴善花,安铁洙（2010）. 小鼠早期胚胎的EFS20/40、EFS40、DAP213和GP25玻璃化法冷冻保存. 江西农业大学学报 32（06）: 1248~1252