摘要:由于长爪沙鼠(Meriones unguiculatus)特殊的生殖生理学和生殖行为学特点,其胚胎移植操作与小鼠有一定差别。本文介绍了长爪沙鼠胚胎移植技术的详细流程,特别是其假孕母鼠制备中的独特步骤,通过这些操作可达到与小鼠相似的胚胎移植成功率。本技术为长爪沙鼠胚胎净化,体外受精以及显微操作奠定了技术基础。
关键词: 长爪沙鼠, 假孕, 胚胎移植
材料与试剂
- 带有托盘鼠笼(苏杭实验动物设备厂)
- 35 mm、10 cm细胞培养皿(美国Corning公司,catalog number: 430165,430167)
- 口吸管(美国Sigma Aldrich公司,catalog number: A5177)
- 孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)(中国宁波第二激素厂)
- 人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)(中国宁波第二激素厂)
- 戊巴比妥那(中国北京索莱宝科技有限公司)
- M2培养基 (美国Sigma Aldrich公司,catalog number: M7167)
- 石蜡油(美国Sigma Aldrich公司,catalog number: M8410)
仪器设备
- 解剖镜(德国Leica公司,EZ4W)
实验步骤
- 假孕受体沙鼠制备
使用10~12周雌性长爪沙鼠作为受体沙鼠进行实验,以10 IU/只的剂量注射PMSG和hCG,注射间隔时间为70 h,具体步骤如下:在第一天16~17时腹腔注射PMSG,第四天14~15时腹腔注射hCG,注射剂量均为10 IU/只。与输精管结扎的雄性沙鼠合笼,因沙鼠阴道栓极易脱落,应在含有托盘(图1)的笼内交配,通过观察托盘内是否有掉落的阴道栓判断交配是否成功。阴道栓检测阳性即可确认作为假孕受体沙鼠即假孕0.5天。
图 1. 带有托盘的鼠笼
- 受精卵移植
(1)麻醉:在胞质注射完成半小时后,将当日检栓/假孕0.5 dpc的假孕沙鼠进行称重,并以100 mg/kg的剂量注射1%戊巴比妥那使其麻醉。沙鼠完全麻醉后将其腹部朝下置于擦手纸上进行后续操作。
(2)暴露生殖道:用眼科剪将沙鼠左侧背部去毛,用75%消毒酒精喷洒背部并用酒精棉球擦净进行消毒。在左侧背部约卵巢的位置剪开约1 cm的小口,依次剪开皮肤、肌肉等,直至可以接触到输卵管和卵巢。用镊子夹住脂肪垫以便将脂肪垫、卵巢和输卵管拉出体外。
(3)将胚胎吸入移卵管:在10 cm细胞培养皿中滴加几滴预热的M2培养基,用口吸管吸出20~22枚存活的培养0.5 dpc的胚胎(如图2所示,一般移植20~22枚卵可产子7个左右,接近于沙鼠自然交配产仔数),并在M2液滴中进行洗涤。在吸入胚胎之前,吸一小段M2培养基、吸一小段空气,反复2~3次,再将胚胎吸入到移卵管中。
(4)胚胎移植:再次用镊子将沙鼠的卵巢和输卵管拉出体外,用小动脉夹夹住脂肪垫固定生殖道,若没有脂肪垫,则夹住血管较少的系膜处。在体视解剖镜下,找到输卵管伞口,用显微镊去除包裹输卵管伞口的透明的膜,沿着输卵管的方向将移卵管插入输卵管伞口,并将胚胎和一个气泡轻吹入沙鼠输卵管中。松开动脉夹,用镊子将沙鼠的卵巢和输卵管及生殖道从切口放回,并缝合切口,为动物保温,直至沙鼠清醒后,放回鼠笼单笼饲养。
图 2. 移植不同数目胚胎后的产仔数
致谢
本研究得到国家自然科学基因(31672375,31872308,31970512,31572348)和“十三五”时期北京市属高校高水平教师队伍建设支持计划(IDHT20170516)资助。
参考文献
- 王妍. (2019). 利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除长爪沙鼠动物模型. 首都医科大学硕士学位论文.
- Wang, Y., Zhao, P., Song, Z., Du, X., Huo, X., Lu, J., Liu, X., Lv, J., Li, C., Guo, M. and Chen, Z. (2020). Generation of gene-knockout Mongolian gerbils via CRISPR/Cas9 system. Front Bioeng Biotechnol 8: 780.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:郭萌, 王妍, 李长龙, 杜小燕, 陈振文. (2021). 长爪沙鼠胚胎移植. // 实验动物胚胎操作实验手册.
Bio-101: e1010930. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010930.
How to cite: Guo, M., Wang, Y., Li, C. L., Du, X., Y., and Chen, Z., W. (2021). Embryo Transfer in Mongolian Gerbils. // Embryo Manipulation Manual of Laboratory Animals.
Bio-101: e1010930. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010930.