斑马鱼的自然交配产卵及胚胎培养技术
Natural Breeding and Embryo Culture of Zebrafish   

材料与试剂

1. 配种缸（上海海圣，货号：HS022）
2. 90 mm培养皿（海门，货号：HC030）
3. 3 mL塑料吸管（海泰，货号：HC001）
4. 鱼捞（上海海圣，货号：HS018）
5. 鱼卵捞网（上海海圣，货号：HS019）
6. 性成熟雌、雄斑马鱼
7. 8%次氯酸钠溶液（3A，catalog number: A04633）
8. 亚甲基蓝（Meryer，catalog number: F70013）
9. NaCl（国药，货号：10019318）
10. KCl（国药，货号：10016318）
11. MgSO₄（国药，货号：20025118）
12. KH₂PO₄（国药，货号：10017608）
13. Na₂HPO₄（国药，货号：10020318）
14. CaCl₂（国药，货号：10005861）
15. NaHCO₃（国药，货号：10018960）
16. 胚胎养殖水（见溶液配方）
    100× E2A储存液
    500× E2B储存液
    500× E2C储存液
17. 胚胎消毒储存液（6%次氯酸钠）（见溶液配方）
18. 亚甲基蓝储存液（5 g/L）（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 斑马鱼循环养殖系统（ESEN, model: AW-RC12）
2. 体视显微镜（olympus, model: SZ2-LGB）
3. 恒温培养箱（精宏，型号：HWS-080，中国）
   

实验步骤

斑马鱼（Danio rerio），英文名称zebrafish，属硬骨鱼类，辐鳍鱼纲（Actinopterygii），鲤形目（Cypriniformes），鲤科（Cyprinidae），鲐属（Danio），原产于印度及孟加拉国的淡水水域，为杂食性热带淡水鱼类(Kimmel, 1989; Engeszer et al., 2007)。因其具有体型小、易于养殖、繁殖周期短、发育迅速、产卵量大、体外受精、体外发育、胚胎透明、基因组与人类同源性高等优势 (Xie et al., 2015; Viets et al., 2016)，近20年来斑马鱼被广泛应用于遗传学 (Davis et al., 2014)、发育生物学 (Driever et al., 1996; Haffter et al., 1996)、神经生物学 (Stewart et al., 2014)、再生和干细胞研究 (Gemberling et al., 2013)、疾病模型和药物筛选 (Rennekamp and Peterson, 2015)、环境毒理学 (Dai et al., 2014)等科研领域。
斑马鱼成体雌鱼为蓝色与银灰色相间条纹，体态丰满，腹部膨大银亮；成体雄鱼为蓝色与柠檬色相间条纹，身材修长，腹部扁平，臀鳍根部略显金黄。斑马鱼的适宜生长温度为20-30 °C，实验室常用养殖水温为25-28 °C，观察胚胎发育进程的标准养殖温度为28.5 °C。因斑马鱼在生理和行为学上呈现出明显的昼夜节律，光暗周期的变化可直接启动其生物节律进而影响斑马鱼的产卵交配，故斑马鱼养殖环境中稳定的光周期对于配鱼产卵的成功至关重要。斑马鱼常用光照周期为14小时明/10小时暗周期 (王明勇，黄国栋，王晗, 2012)，每个明周期开始后3小时内为繁殖产卵活跃期。斑马鱼的自然寿命约3到5年，实验室环境下性成熟期约为3个月，而6至18月龄的斑马鱼繁殖能力较强。在合适的饲养条件下，成年斑马鱼全年皆可交配产卵，两次产卵仅需间隔一周，一对健康的成年斑马鱼一次交配可产卵200枚以上。所产卵为非黏性卵，直径约为1 mm，沉积于缸底(Brown et al., 2016)。下文将详细介绍实验室内斑马鱼的自然繁育过程。

1. 实验前准备
   1. 为提高斑马鱼的产卵量，应在交配前1至2周对雌雄成鱼增添活饵料投喂。长期规律地用于产卵的成鱼应坚持每日2次以上活饵料饲养。
   2. 配鱼产卵的前一天应准备装有养殖水的配种缸，水量约占配种缸体积的三分之二。配种前对鱼进行投喂。配种缸由内缸、外缸、隔板、盖板四部分组成，外缸盛水可保障鱼适宜生存环境；内缸下方为镂空结构，便于鱼卵下沉，可阻止亲鱼接触吞掉鱼卵；隔板分离成年雄雌鱼，防止雌雄鱼接触过早相互攻击或者提前接触产卵；盖板放置于配种缸顶部，防止鱼跳出（图1）。
      
      
      图1. 配种缸内挡板隔开的雌雄鱼（隔板右侧是1尾雄鱼，左侧是2尾雌鱼）
      
      
2. 斑马鱼的选取与配鱼
   1. 成年雌雄鱼鉴别：相同饲养条件下，同龄成年雌鱼体型比雄鱼稍大，腹部也更膨大。但是由于卵巢孕育鱼卵的情况不同，雌鱼的腹部也可能相对扁平；而雄鱼在刚刚摄食或腹腔生长肿瘤等情况下也可能腹部膨大，因此观察体型只能对分辨雌雄鱼起到辅助作用。在实验中更推荐使用观察体色的方式来判断雌雄鱼。雌鱼的条纹偏银色，腹部膨大银亮，体型丰满；雄鱼体型修长，条纹为柠檬黄，臀鳍根部呈现金黄色（图2）。
   2. 下午投喂一小时后，将成年雌、雄鱼按照1:1或2:1比例放入准备好的配种缸内，密度不易过高(常规0.8L配种缸内不应放置超过4尾鱼)，雌雄鱼用隔板分开，并盖上顶部盖板（图1）。
   3. 将配种缸放置在鱼房养殖环境下，按照斑马鱼日常作息规律，放置过夜。
      
      
      图2. 成年野生型（AB品系）斑马鱼。图片上方为雄鱼，体型修长，体色为柠檬色，腹部扁平。图片下方为雌鱼，体型丰满，腹部膨大，体色银灰。同龄雌鱼较雄鱼体型略大。
      
      
      
3. 自然交配与鱼卵收集
   1. 次日早上按照鱼房正常光周期给予光照，并给配种缸内斑马鱼换水。明周期开始后的半小时内，雌雄鱼会出现明显的相互吸引行为，频繁接近隔板，在隔板附近区域游动。此时抽取隔板，雌雄鱼会迅速开始彼此接触，并可能产卵。明周期开始后三小时左右，如仍未抽取隔板让雌雄鱼接触，则雌鱼可能开始将卵巢内的卵子逐渐降解吸收。此后，即便给予雌雄鱼接触机会，交配产卵的成功率会大大降低。因此，收集鱼卵的最佳时间段为明周期开始后的30分钟之内，如需要延迟收集受精卵，最多不要超过明周期开始之后的3小时。换水方式为：准备另一外缸，加入新鲜养殖水至体积的三分之一，将内缸（内有斑马鱼）转移至其中。
      抽取隔板使雌、雄鱼接触，雌、雄鱼在明周期开始后很快出现追逐行为，并开始交配产卵（视频1）。交配期间，尽量避免干扰。原缸水体经鱼过夜排泄废物，氨氮含量可能过高，换水可以降低水体氨氮含量，保持水体清洁度，同时适量减少缸内水量，水层浅有助于雌雄鱼交配产卵。如为了试验需要，例如进行显微注射期间，为了保证收集的受精卵处于1-2细胞期，则可通过控制抽取隔板的时间，或更换外缸等方式，保证试验期间都可收集到合适年龄的受精卵。
      
      
      
      视频1. 斑马鱼的自然交配产卵
      
      
   2. 待亲鱼产卵后，鱼卵会沿配种内缸底部缝隙沉积于外缸底部。产卵一定时间后，可以把亲鱼再换置到一缸干净养殖水内，亲鱼可能会继续产卵。产卵结束后，开始收集配种缸内的鱼卵。将外缸内的水缓慢倒入鱼卵捞网，鱼卵会被收集在捞网中，之后用胚胎养殖水清洗鱼卵2~3次，清洗过程中用吸管弃掉粪便、死卵等杂质。
   3. 放置鱼卵到装满胚胎养殖水的平皿内，在28.5 °C恒温培养箱内养殖，可无光照培养，但如条件允许或从事与生物节律有关的科研工作，培养箱与成鱼养殖环境的光周期保持一致或根据实验需要进行调节。对于直径为90 mm的培养皿，鱼卵养殖密度在50颗/皿为宜。
   4. 在培养皿外贴上标签，标签上须注明胚胎名称，出生日期等信息（图3）。
      
      
      图3. 自然配鱼收到的鱼卵
      
      
      
4. 受精卵的分拣与消毒
   1. 分拣：待收集鱼卵发育3至6小时之间于显微镜下分拣出受精卵。28.5 °C培养条件下，产卵后约3小时进入1000细胞期，6小时胚盾开始形成，期间是较容易观察分辨受精与未受精鱼卵的时期。只有正常受精的鱼卵才能发育成胚胎。
   2. 消毒：为保证养殖系统的健康，分拣出来的胚胎参照如下方式进行消毒（胚胎应在受精24 小时内，卵膜依然完整的情况下进行消毒）(Westerfield, 2007)：
      1)

      滤去胚胎养殖平皿中的养殖水，向平皿中加入适量现配的胚胎消毒液（0.003%次氯酸钠溶液），加入体积必须可以完全淹没需消毒的胚胎。
      2)

      将挑拣出的胚胎放置于消毒工作液中5分钟。期间轻轻地摇动平皿，保证胚胎卵膜与消毒液充分接触。
      3)

      滤去胚胎消毒液，在平皿中加入灭菌胚胎养殖水，加入体积必须完全淹没胚胎，放置5分钟，期间轻轻地摇动平皿，保证胚胎卵膜得到充分清洗以去掉残留氯离子。
      4)

      重复操作步骤1)-3)的步骤1次。
      5)

      用灭菌胚胎养殖水反复清洗胚胎2次，保证次氯酸钠全部清洗掉。
   3. 消毒后的胚胎放置于含0.5 mg/L亚甲基蓝的胚胎养殖水中，并于28.5 °C恒温培养箱内静水养殖，其中亚甲基蓝的作用是抑制霉菌生长(Varga, 2011)。
   4. 每天检查胚胎的发育状况，挑出败育的死胚和发育畸形的胚胎，每日换水一次。

结果与分析

产卵当日，抽取隔板后2小时，一对成年斑马鱼正常情况下可产卵200枚以上，胚胎通体透明，卵膜在水中1至2分钟后即可膨起，10分钟后动物极膨出（图4）。
收集后的鱼卵于显微镜下观察，可以看到正常受精的鱼卵在28.5 °C标准培养温度下，动物极膨出45分钟发生第一次卵裂，进入2细胞期（图4A）；3小时后进入1000细胞期（图4B）；5小时后进入50%外包期，细胞开始内卷，之后依次出现胚环及胚盾（图4C）；而未受精鱼卵可能在早期也会膨起动物极，并发生1-2次假性细胞分裂，但是分裂不规律，而且不会继续发育（图4D）。待收集鱼卵发育至1000细胞期时于显微镜下分拣出受精卵，养殖于含0.5 mg/L亚甲基蓝的胚胎养殖水中。


图4. 受精和未受精鱼卵的鉴别. A. 为2细胞期胚胎；B. 为1000细胞期胚胎；C.为胚盾（shield）期胚胎；D. 为发生过假性分裂的未受精鱼卵.

失败经验

自然交配后，斑马鱼不产卵、产卵量少可能有以下几方面原因：

1. 产卵用雌雄斑马鱼未性成熟。正常养殖情况下，斑马鱼3个月左右性成熟。如喂养不足，无活饵料喂养且使用的颗粒饲料蛋白质含量不高，会造成3月龄的斑马鱼仍未性成熟的情况，此时配鱼就会不产卵。足量高蛋白和活饵料喂养可以促进斑马鱼发育，尽早性成熟。
2. 已性成熟的斑马鱼投喂不足。斑马鱼日常投喂饵料不足，或者投喂的颗粒饲料中淀粉含量过高，都可能导致其不产卵或者产卵量低。故用于产卵的斑马鱼每日不得投喂少于2顿活饵料，或者投喂的颗粒性饲料应有较高蛋白质含量。
3. 斑马鱼性成熟后第1、2次交配可能不产卵、产卵周期较长，产卵量少。坚持足量的高蛋白喂养，随着斑马鱼的继续发育，产卵量情况就会改善。6-18个月的斑马鱼是最适产卵年龄。
4. 频繁使用的斑马鱼雌雄未分开饲养。未分开的雌雄鱼可能在鱼缸内完成交配产卵并吞食掉鱼卵，而在人工配鱼的时候不再产卵，故每月2次以上用于产卵的斑马鱼应雌雄分开饲养。
5. 雌雄分开饲养的斑马鱼，长期未进行交配产卵之后，首次使用可能产卵少、受精率低，或胚胎死亡率高。这是由于长时间不交配产卵的雌鱼可能卵子质量降低、卵巢积蓄坏卵或患卵巢炎症等相关疾病。因此，非经常用于交配产卵的斑马鱼应雌雄混合饲养。已雌雄隔离时间过长的雌鱼可人工协助清除腹内的坏卵，具体方法为：将雌鱼充分麻醉，侧面放置于平皿中，用左手食指轻轻抵住鱼背，右手食指轻轻挤压雌鱼腹部，看到泄殖孔中排出坏卵（图5），再精心养殖一周后可用于自然交配产卵。
   
   
   图5. 麻醉按压雌鱼腹部操作图
   
   
6. 雌雄鱼不追逐，无法形成正确的伴随游动。可能原因如下：
   
   1. 雌雄鱼年龄和体型相差过大。斑马鱼胚胎为体外受精、体外发育，受精过程需要雌雄鱼有正常的伴随游动。年龄和体型相差过大的斑马鱼可能无法形成正确的伴随游动，体量过小的雄鱼也可能不敢追逐体量较大的雌鱼，造成产卵量少或者不产卵，故配对产卵应使用年龄相仿，体型大小接近的斑马鱼。
   2. 1比1比例配鱼时未插隔板。配种缸内未用隔板将雌雄鱼分隔过夜可能会导致雌雄鱼相互撕咬，而在明周期开始后无法正常交配产卵，故配鱼时应严格按照标准操作，配种缸内插上隔板过夜。
   3. 交配环境不利于斑马鱼繁殖。交配环境中的水温和室温太高或者太低均不利于斑马鱼追逐产卵，光照周期紊乱会直接造成斑马鱼不产卵，配种缸内水位过高也会影响雌雄鱼追逐产卵。故交配环境需保持适合斑马鱼生长繁殖的26-28 °C，光照周期稳定，配种缸置换新鲜养殖水且保持较浅的水层，都有利于促进雌雄鱼追逐。此外，交配过程中尽量避免人为干扰。
   4. 彼此释放产卵交配信号太弱无法感知，这时可以考虑第二次配鱼时更换雌/雄伴侣或者加强饲养一段时间再次让鱼交配。
      
7. 收集的鱼卵高密度放置。培养皿内放置鱼卵密度过高可能会导致水质变坏，造成鱼卵较高死亡率，故鱼卵养殖密度应适宜，以每90 mm培养皿中放置50枚胚胎为宜。
   

溶液配方

1. 胚胎养殖水（Embryo Medium）
   100× E2A储存液
   取140 g NaCl， 6 g KCl，19.2 g MgSO₄，3.3 g KH₂PO₄，1.1 g Na₂HPO₄溶于1600 mL无菌去离子水中，4 °C长期储存。
   
   500× E2B储存液
   取11 g CaCl₂溶于200 mL无菌去离子水中，-20 °C长期储存。
   
   500× E2C储存液
   取6 g NaHCO₃溶于200 mL无菌去离子水中，-20 °C长期储存。
   
   胚胎养殖水（0.5×）
   取100 mL 100× E2A储存液，20 mL 500× E2B储存液，20 mL 500× E3C储存液于19 L无菌去离子水中，调节pH至7.0后定容至20 L，配置成胚胎养殖水（0.5×），高温消毒后常温短期储存。
2. 胚胎消毒储存液（6%次氯酸钠）
   取8%次氯酸钠溶液中加入适量的去离子水，配制成浓度6%的储存液，常温避光保存，保质期6个月。
   使用时，取100 μL胚胎消毒储存液加入到200 mL的灭菌胚胎养殖水中，配置成胚胎消毒液（0.003%次氯酸钠溶液），混匀使用。胚胎消毒液必须现用现配。所有含氯溶液均不可带入鱼房，请在鱼房以外环境进行操作。
3. 亚甲基蓝储存液（5 g/L）
   取0.5 g亚甲基蓝粉末溶于100 mL灭菌去离子水中，配制成5 g/L的亚甲基蓝储存液，常温长期储存。
   使用时，取100 μL亚甲基蓝储存液溶于1000 mL胚胎养殖水中，混匀使用，胚胎养殖水中亚甲基蓝的终浓度为0.5 mg/L。
   

致谢

国家斑马鱼资源中心得到科技部财政部国家科技资源共享服务平台；国家重点研发计划（2018YFA08010000）；中国科学院生物资源科技服务网络计划动物实验平台项目；湖北省自然科技资源库等项目的支持。

参考文献

1. Brown, D. R., Samsa, L. A., Qian, L. and Liu, J. (2016). Advances in the Study of Heart Development and Disease Using Zebrafish.J Cardiovasc Dev Dis 3(2).
2. Dai, Y. J., Jia, Y. F., Chen, N., Bian, W. P., Li, Q. K., Ma, Y. B., Chen, Y. L. and Pei, D. S. (2014). Zebrafish as a model system to study toxicology. Environ Toxicol Chem 33(1): 11-17.
3. Davis, E. E., Frangakis, S. and Katsanis, N. (2014). Interpreting human genetic variation with in vivo zebrafish assays. Biochim Biophys Acta 1842(10): 1960-1970.
4. Driever, W., Solnica-Krezel, L., Schier, A. F., Neuhauss, S. C., Malicki, J., Stemple, D. L., Stainier, D. Y., Zwartkruis, F., Abdelilah, S., Rangini, Z., Belak, J. and Boggs, C. (1996). A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.Development 123: 37-46.
5. Engeszer, R. E., Patterson, L. B., Rao, A. A. and Parichy, D. M. (2007). Zebrafish in the wild: a review of natural history and new notes from the field.Zebrafish 4(1): 21-40.
6. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R. and Poss, K. D. (2013). The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet 29(11): 611-620.
7. Haffter, P., Granato, M., Brand, M., Mullins, M. C., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Jiang, Y. J., Heisenberg, C. P., Kelsh, R. N., Furutani-Seiki, M., Vogelsang, E., Beuchle, D., Schach, U., Fabian, C. and Nusslein-Volhard, C. (1996). The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development 123: 1-36.
8. Kimmel, C. B. (1989). Genetics and early development of zebrafish.Trends Genet 5(8): 283-288.
9. Rennekamp, A. J. and Peterson, R. T. (2015). 15 years of zebrafish chemical screening. Curr Opin Chem Biol 24: 58-70.
10. Stewart, A. M., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R. and Kalueff, A. V. (2014). Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci 37(5): 264-278.
11. Varga, Z. M. (2011). Aquaculture and husbandry at the zebrafish international resource center. Methods Cell Biol 104: 453-478.
12. Viets, K., Eldred, K. and Johnston, R. J., Jr. (2016). Mechanisms of Photoreceptor Patterning in Vertebrates and Invertebrates.Trends Genet 32(10): 638-659.
13. Westerfield, M. (2007). The Zebrafish Book, 5th Edition.University of Oregon Press. Eugene, Oregon.
14. Xie, X., Pan, L. and Sun, Y. (2015). Growing with the world: rapid development of the zebrafish research in China and the China Zebrafish Resource Center. Sci China Life Sci 58(4): 396-399.
15. 王明勇，黄国栋，王晗 (2012). 斑马鱼生物钟研究进展. 遗传 34(9): 1133-1143.