斑马鱼胚胎显微注射技术
Microinjection Techniques of Zebrafish Embryos   

材料与试剂

1. 10 μL吸头（Axygen, catalog number: T-300）
2. 橡皮泥（得力, 货号: 7021）
3. 3 mL塑料吸管（海泰, 货号: HC001）
4. 鱼卵捞网（上海海圣, 货号: HS019）
5. 无菌注射过滤器（Millipore, catalog number: SLGP033RB）
6. 台微尺（OPLENIC, catalog number: 106012） 
7. 注射玻璃针（WPI, catalog number: TW100F-4）
8. 镊子（VETUS, catalog number: SS-JP）
9. 90 mm培养皿（海门, catalog number: HC030）
10. 10x10 mm培养皿（海门, catalog number: HX-D12）
11. 显微注射用平皿制备模具（WPI, catalog number: Z-MOLDS）
12. 性成熟雌、雄斑马鱼
13. 甲基纤维素M450（康朗生物，KL-11268）
14. 酚红（Sigma-Aldrich, catalog number: P3532）
15. 矿物油（Sigma-Aldrich, catalog number: M8410）
16. Tricaine（Sigma, catalog number: E10521）
17. 琼脂糖粉末（BIOWESTE, catalog number: 111860）
18. 0.5% 酚红（见溶液配方）
19. 麻醉剂Tricaine 储液（见溶液配方）
20. 4%的甲基纤维素溶液（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 0.1-2.5 μL移液器（Eppendorf, catalog number: 3120000216）
2. 磁力搅拌器（梅颖浦, 型号: MYP11-2）
3. 拉针仪（Sutter, model: P-1000）
4. 显微注射仪（WPI, model: PV820）
5. 显微操纵器（WPI, model: M3301）
6. 体视显微镜（OLYMPUS, model: SZ61）
7. 恒温培养箱（精宏，型号：HWS-080）
   

实验步骤

1. 显微注射仪器准备
   显微注射需要一套精密的显微操作设备（图1A），主要包括以下几个组成部分。
   1. 显微注射仪（图1B）。显微注射仪连接氮气供给罐，用于对注射针内的溶液施加气压脉冲，利用可调节气压脉冲将精确微量体积的样品注射至胚胎体内。注射器和一个脚踏板相连，帮助实验人员在双手进行实验的同时可以通过踩踏板激活压力脉冲将实验样品注射入胚胎。
   2. 显微操纵器（图1C）。用于注射针的精准位移控制，可以在显微注射过程中对注射针的运动进行精密调节。
   3. 体视显微镜（图1D）。用于显微注射时观察整个实验过程，可以在显微注射过程中看到胚胎并对注射针所在的位置聚焦。
      
      
      图1. 显微注射仪器. A. 全套搭建好的显微注射设备；B. 显微注射仪；C. 显微操纵器；D. 体视显微镜。
      
      
      
2. 显微注射样品准备
   注射样品需提前准备，根据不同的实验目的，注射样品通常包括质粒DNA、RNA、morpholino等，可以在注射样品中加入酚红便于观察注射过程(Holder and Xu, 1999; Rosen et al., 2009; Yuan and Sun, 2009)。
3. 显微注射针准备
   在显微注射实验前，需使用拉针仪（图2A）拉制一定数量，针尖大小以及针尖角度适合（图2B）的注射针(Zhao et al., 2018)。拉制好的针可以放置在10x10 mm培养皿中，内部用橡皮泥固定以防晃动（图2C），损伤注射针针尖。注射针最好提前一天准备，且不宜一次准备过多，避免长期存放使注射针沾染空气中的灰尘颗粒引起针尖阻塞。
   
   
   图2. 显微注射针准备. A. 拉针仪；B. 拉制好的注射针针尖；C.放入平皿的注射针。
   
   
4. 注射用平皿的制备
   称取1.5 g琼脂糖粉末溶于100 mL去离子水中，微波炉加热至溶解，将约15 mL琼脂糖液倒入90 mm培养皿中。待其稍凉至手可触摸但尚未开始凝固后，将平皿制备模具缓慢倒扣于琼脂糖液面上。待其完全凝固后，先用尖镊子或刀片沿着模具四边划一下，然后从其一侧短边向上拔出模具，即得到显微注射用平皿（图3A）。每次使用前后都用灭菌水清洗，4℃保存，可重复使用。
5. 胚胎准备
   1. 配鱼。注射前一天，将成年雌、雄鱼按照1:1或2:1的比例放置于配种缸中，用隔板隔开，盖好盖子。将配种缸放置在平时养殖的鱼房台面上，让斑马鱼保持正常作息。
   2. 亲鱼产卵。进行显微注射实验的早上，抽去配种缸中的隔板，雌雄鱼接触，一般在十分钟左右开始交配产卵。在具体实验中，可以先抽取2缸鱼的隔板，使其接触产卵，随后根据实验进度再适时抽取其它缸的隔板，以保证所收集的鱼卵都处于发育早期。在抽取隔板前，可先将内缸连同亲鱼置换到另一盛有干净养殖水的外缸中，以促进亲鱼产卵并节省清洁胚胎的时间。
   3. 收集受精卵。亲鱼产卵后，用鱼卵捞网收集鱼卵，应尽量收集受精20分钟内的鱼卵，即对于同一缸亲鱼，两次收集鱼卵的时间间隔不得超过20分钟，以保证显微注射的目标胚胎都处于接近的发育阶段，并在胚胎4细胞期前完成注射。将鱼卵倒入装有养殖水的培养皿中，吸走其中的杂质。用吸管将鱼卵排列到显微注射平皿的凹槽中，胚胎排列在凹槽中可以避免注射过程中胚胎滑动，每排排列40枚左右胚胎，然后清除胚胎周围多余的养殖水就可以用于注射了（图3A）。
   4. 注射用胚胎的发育阶段控制。胚胎在受精后1至2分钟内卵膜将膨起，之后10分钟动物极膨起，细胞形态变得较为规整，此时可以开始注射。受精后45分钟左右（标准培育温度28.5 °C下所需时间，可因实验时室温情况有所不同）发生第一次卵裂，受精后1小时发生第二次细胞分裂达到4细胞期。样品通常在1至4细胞时期内进行注射。
      
      
      
6. 斑马鱼胚胎显微注射
   1. 开启显微注射仪。首先打开氮气罐总阀，调节压力至0-0.5 MPa之间。之后打开显微注射仪开关，调节主操作面板上的注射压力值（eject pressure）到15-20 psi之间，调节脉冲时间至40-50毫秒之间，调节保持压力值（hold pressure）在0.5 psi左右避免注射时样品外流或回吸。之后在实验过程中，还需根据针口的大小进行微调，直至合适的注射压力和脉冲时间。不同厂家的显微注射仪显示方式和设置会略有不同，一般来讲注射压力控制在15-25 psi之间，脉冲时间在30-60 ms之间，是斑马鱼胚胎显微注射的常用条件。
   2. 上样装针。将拉制好的注射针用橡皮泥竖直固定，然后吸取1至3 μL显微注射样品，逐滴地将注射样品滴在注射针顶端，在注射针内芯引导下，样品通过虹吸作用将汇聚于玻璃管针头部分（图3B）。
   3. 针尖制备。将上好样品的注射针插入持针器中固定，然后在体视镜最高放大倍率下，用尖头镊子将注射针的尖端夹断（图3C），形成注射针口。针尖制备的步骤需配合下面的剂量调整逐渐进行，注射针尖太细则很难刺破卵膜，注射针尖太粗则会给胚胎造成比较大损伤。
   4. 注射剂量调整。将台微尺放置到体视显微镜下，其上滴一滴矿物油，将注射针小心地伸入矿物油中，踩动踏板压将一滴注射液送到矿物油中，液滴在油中形成比较完美的球型。通过观察台微尺上的液滴直径，推算注射样品的体积大小（表1）。注射体积与针尖大小、注射压力、脉冲时间、溶液粘度和外部压力有关，理想的注射剂量为胚胎体积的10%，一般为1 nl，因此液滴直径要控制在0.1至0.15 mm之间。注射剂量应控制在1.8 nl以内，注射剂量过大体积会损伤胚胎，过小可能影响定量精确度和扩散的均匀程度（图3D）。
      
      表1. 显微注射台尺标准
      

      液滴直径	注射剂量
      0.125mm	1nl
      0.15mm	1.76nl
      0.16mm	2.15nl

      
      
   5. 注射。将待注射的胚胎放置到体视显微镜下，用低倍物镜对准胚胎调焦，调节操作器轻轻的落下针尖，将注射针尖推入视野中心，通过显微操纵器的微调调整注射针位置，直到清晰见到针尖为止。进一步调整显微镜焦距和注射针及胚胎的位置，使胚胎和注射针尖均达到最佳清晰程度。对于不同的样品，显微注射的操作要求各有不同。注射mRNA或Morpholino样品，应把样品注射到动物极下方的卵黄区域内；注射DNA 样品，则常常需要注射针穿过卵黄，把样品注射到动物极内。
      1)

      卵黄注射：卵黄注射是将样品注射到卵黄中，细胞质的流动和扩散会将注射样品带入到动物极（图3E）。推动操纵器，小心进针，使注射针针尖穿过卵壳和卵黄膜进入卵黄，迅速踩动脚踏开关将样品注入胚胎，然后将针拔出。由于在注射样品中加入了酚红，所以可以看到样品在胚胎中扩散流动。成功注射到胚胎卵黄后，注射部位会出现淡淡的红色，约10秒才会渐渐散去，如果红色马上散去，说明注射液注入在绒毛膜中，需要重新注射。然后移动平皿进行下一个胚胎注射。通过卵黄注射相对比较容易，胚胎存活率高，但是样品需要时间扩散到细胞质中。
      2)

      动物极注射。由于动物极的膜相对比卵黄膜结构更加严谨，直接注射动物极会对胚胎造成较大的损伤，所以首先调整胚胎的朝向，使胚胎的动物极朝向平皿底部。然后从卵黄处进针，穿过卵黄到达动物极，将注射样品直接注射到动物极中，这个操作过程需要平稳，避免晃动（图3F）。动物极注射需要正确的胚胎定位和注射技术，相对耗时较长，胚胎死亡率也比注射入卵黄高，但是DNA样品需注射入动物极才能高效率发挥作用。
   6. 胚胎养殖。注射结束后，将注射针取下，依次关闭氮气阀门、显微注射仪、体式镜。用滴管吸取养殖水将胚胎冲洗至90 mm平皿内，置入28.5 °C培养箱培养。待胚胎发育3至6小时后，在显微镜下挑出未受精的鱼卵（一直处于1细胞期或者只发生假性分裂）和死亡的胚胎（内部呈现白色絮状），对于发育畸形胚胎要仔细观察和统计，做好记录后再移除，并应进行重复试验，以确认发育畸形是显微注射的物理伤害导致，还是基因操作引发的表型。为保证养殖系统的健康，挑拣出来的胚胎用胚胎消毒液消毒2次，再用胚胎养殖水冲洗干净。消毒后的胚胎放置于含0.5 mg/L亚甲基蓝的胚胎养殖水中，并放置于28.5 °C恒温培养箱内静水养殖，每日换水并及时吸去死胚。
      
      
      图3. 斑马鱼胚胎显微注射操作. A. 待注射的胚胎排列在注射用培养皿凹槽中；B. 装针上样； C. 显微镜下的针尖制备操作；D. 通过将液滴注入放在台微尺上的矿物油中测量注射样品体积; E. 样品注射入卵黄； F. 样品注射入动物极；红色箭头指出酚红标记样品的情况。

结果与分析

通过向1至4细胞期的斑马鱼胚胎中注射不同的DNA、RNA、morpholino等样品，可以实现基因突变或转基因品系的构建、短时间过表达目的蛋白或敲降目标基因表达等目的。对于不同的样品，可根据实际情况和预期的表型，选择基因型鉴定与表型观察的时间。现分别以注射质粒DNA pT2(tpma:eGFP-UTRglobin)和chordin 基因mopholino为例，介绍显微注射的结果和胚胎荧光及表型观察。
为了便于观察显微注射的结果，首先对胚胎进行麻醉和固定。将发育至1dpf (day post fertilization)的斑马鱼胚胎脱膜后，浸泡于0.016%的Tricaine中进行麻醉。麻醉剂可以使鱼类代谢减缓，氧的需求量减少，从而方便进行实验操作。待胚胎麻醉后，将胚胎小心地嵌入4%的甲基纤维素中，固定位置避免移动，用毛细针将胚胎调小心地整到合适观察的位置。
质粒pT2(tpma:eGFP-UTRglobin)是通过肌肉特异性启动子tpma激活eGFP蛋白表达(Pang et al., 2015)。注射质粒后，胚胎发育至1dpf时可以在肌肉组织中看到特异表达绿色荧光蛋白（图4A）。
chordin是骨形态发生素（bone morphogenetic proteins，BMPs）的拮抗因子，特异地在表达于斑马鱼原肠胚的胚盾区域。在斑马鱼早期胚胎发育过程中，BMPs的浓度和活性梯度直接影响斑马鱼背腹轴的发育，BMPs整体活性过高将导致胚胎的腹部化(Kishimoto et al., 1997)。注射chordin mopholino敲低chordin表达，会造成BMP信号的过度增强，胚胎就会发生腹部化，具体表现为发育至1dpf的胚胎头部变小、血岛增大、腹侧尾鳍褶皱等（图4B）。


图4. 显微注射1dpf胚胎的示例. A. 注射质粒 pT2(tpma:eGFP-‘UTRglobin)后，1dfp的胚胎在肌肉细胞中特异表达绿色荧光蛋白； B. 注射chordin mopholino后，1dfp的胚胎产生典型的腹部化表型。

失败经验

显微注射的操作过程中有许多细节影响实验的成功率，需要特别关注，否则容易造成实验失败，主要包括以下几方面。

1. 注射针堵塞，主要原因是注射样品有杂质。显微注射的样品种类多样，包括mRNA、DNA或蛋白质等，注射样品中是否存在固体悬浮物等杂质是关系到注射效率高低的重要因素之一。所有样品使用前需要先离心，使可能存在的固体悬浮物沉淀到管底，取上清液做注射样品，避免堵住针头。如果发生堵塞，通常可通过轻夹针尖、增大输出压力得以缓解。如果不能解决，需更换新的注射针，重新上样。
2. 注射样品量过大或过小，主要是针尖制备操作不当造成的。进行显微注射时，如何准备好针尖是显微注射成功和保证效率极其重要的因素。准备针尖时，将注射针尖一点点剪断，不宜一次剪太多。注射针尖如果太粗，会导致样品流量过多，且给受精卵造成过大的伤口，易于裂解；太细则导致针内样品流出速率过慢，易堵塞针尖而使样品无法顺利流出，且难以刺穿卵膜，影响注射效率。
3. 调节注射节气压不当。主要表现在测量液滴大小的时候，没有调控至合适的正压和负压。正压过大会导致脉冲结束后多余样品流入胚胎，而负压过大会导致脉冲结束后样品甚至胚胎内容液被回吸出来。正确的做法是在测量液滴大小的时候，观察液滴的稳定性。压力调节合适的时候，一个脉冲压力产生的液滴不会在脉冲结束后持续扩大或者在慢慢缩小，而是在脉冲结束后轻松脱离针尖，在矿物油内形成稳定不变的液滴。此外，在注射进行中如需对压力进行微调，压力调节不宜变化太快，否则会造成注射量难以控制，导致胚胎内环境改变过快过大甚至胀破细胞。
4. 显微注射后胚胎死亡率过高，有多种可能的原因。
   1. 注射操作不熟练。注射完毕，慢慢抽出注射针，要一气呵成，避免受精卵内物质随着注射针抽出，造成受精卵的损伤及堵针。
   2. 样品浓度过高也是胚胎死亡率高的一个常见因素。针对不同的样品初次注射时，可尝试不同的浓度梯度，摸索条件，找到适宜实验目的，且不产生过多毒性的注射样品浓度。
   3. 后续养殖的不精细。注射后胚胎需要细心照顾，影响胚胎发育的外界因素主要有：水温(28.5 °C恒温培养箱养殖)；水质（及时挑出死胚和杂质并每日换水）、养殖密度（对于直径为90 mm的培养皿，胚胎养殖密度在50颗/皿为宜）等。

溶液配方

1. 0.5% 酚红
   称取0.5 g酚红，加去离子水100mL； 混合后放在磁力搅拌器上搅拌30分钟左右；酚红中如存在块状的，需要先在纸上揉碎，否则会造成溶解困难。充分溶解后，使用0.45 μm无菌注射过滤器过滤。配制注射溶液时，稀释酚红终浓度至0.025-0.050%。
2. 麻醉剂Tricaine 储液
   400 mg Tricaine溶于90 mL去离子水中，加入2.1 mL Tris（1 M，pH9.0）调节pH至7.0，定容至100 mL，4 °C 短期储存，-20 °C长期储存。使用时，将4.2 mL tricaine储液稀释于100 mL 去离子水中，工作液要求现用现配。
3. 4%的甲基纤维素溶液
   在容器内加入50 mL的去离子水，并加热到70 °C。逐渐加入3 g甲基纤维素粉末M450，并不停的搅拌，制备出热水淤浆。在热水淤浆中加水至100 mL，充分搅拌之后冷却，4 °C保存。使用时，放置到28 °C水浴中充分回温后使用。
   

致谢

国家斑马鱼资源中心得到科技部财政部国家科技资源共享服务平台；国家重点研发计划（2018YFA08010000）；中国科学院生物资源科技服务网络计划动物实验平台项目；湖北省自然科技资源库等项目的支持。

参考文献

1. Holder, N. and Xu, Q. (1999). Microinjection of DNA, RNA, and protein into the fertilized zebrafish egg for analysis of gene function. Methods Mol Biol 97: 487-490.
2. Kishimoto, Y., Lee, K. H., Zon, L., Hammerschmidt, M. and Schulte-Merker, S. (1997). The molecular nature of zebrafish swirl: BMP2 function is essential during early dorsoventral patterning. Development 124(22): 4457-4466.
3. Pang, S. C., Wang, H. P., Zhu, Z. Y. and Sun, Y. H. (2015). Transcriptional Activity and DNA Methylation Dynamics of the Gal4/UAS System in Zebrafish. Mar Biotechnol (NY) 17(5): 593-603.
4. Rosen, J. N., Sweeney, M. F. and Mably, J. D. (2009). Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.J Vis Exp(25).
5. Yuan, S. and Sun, Z. (2009). Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp(27).
6. Zhao, Y., Sun, H., Sha, X., Gu, L., Zhan, Z. and Li, W. J. (2018). A Review of Automated Microinjection of Zebrafish Embryos. Micromachines (Basel) 10(1).