斑马鱼原始生殖细胞移植或替换技术
Primordial Germ Cells Transplantation or Replacement in Zebrafish   

材料与试剂

1. 玻璃吸管（友乐博, 货号: UTP1007）
2. 90 mm塑料平皿（海门, 货号: HC030）
3. 野生型斑马鱼（国家斑马鱼资源中心，CZRC）
4. 琼脂糖粉末（BIOWESTE, catalog number: 111860）
5. NaCl（国药, 货号: 10019318）
6. KCl（国药, 货号: 10016318）
7. MgSO₄∙7H₂O（国药, 货号: 10013018）
8. Ca(NO₃)₂∙4H₂O（阿拉丁, 货号: C100076）
9. HEPES（Sigma-Aldrich, 货号: H7523）
10. 青链霉素双抗（Gibco, catalog number: 15140-122）
11. 酚红（Sigma-Aldrich, catalog number: P3532）
12. dead end吗啉反义寡核苷酸（dnd MO）（订购自Gene Tools公司）
13. GFP-UTRnos3 mRNA，cas9-UTRnos3 mRNA，buc mRNA，pou5f3 gRNA（自备）
14. 30× Danieau's buffer（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 250 mL锥形瓶（蜀牛, 货号: RZXP-0250）
2. 1 mL医用注射器（金塔, 货号: JT-001）
3. 移植用平皿制备模具（Adaptive Science Tools, 货号: PT-1）
4. 玻璃毛细管，显微注射用（WPI, 货号: W100F-4）
5. 玻璃毛细管，细胞移植用（WPI, 货号: TW100-4）
6. 显微注射仪（WPI, model: PV820）
7. 拉针仪（Sutter Instrument, model: P1000）
8. 煅针仪（Narishiga, model: MF-900）
9. 磨针仪（Narishiga, model: EG-400）
10. 油压细胞移植器（Eppendorf, model: CellTram vario）
11. 显微操作仪（Narishiga, model: MMN-2）
12. 光学体视显微镜（Olympus, model: SZ61）
13. 体视荧光显微镜（Olympus, model: MZX7）
14. 台式离心机（ThermoFisher, model: Pico17）
15. 恒温培养箱（精宏，型号：HWS-080）
    

实验步骤

原始生殖细胞（Primordial Germ Cells，PGCs）是成熟配子在胚胎期的祖先细胞，是唯一可以传递遗传物质的胚胎细胞。在发育早期针对PGC开展相关的胚胎实验操作将有助于我们进一步了解其遗传和发育特性，为品系构建、种质保护、品种改良、育性调控以及某些遗传性疾病的治疗等研究和应用提供有力的技术支撑。在斑马鱼中，对于某些早期发育必需基因（致死基因），如pou5f3，针对PGC进行基因编辑，结合同种异体PGC移植或替换，可以得到能够产生该类基因突变配子的成鱼，从而避免直接进行全胚基因敲除导致的早期胚胎致死效应。如能同时得到可产生突变配子的雌、雄鱼，则利用该方法在F1代即可快速得到该基因的母源合子突变体，从而大大缩短品系建立的时间周期。此外，在斑马鱼不同品系甚至异种鱼类间进行PGC移植或替换，一方面可以实现品种改良，如将经济价值较高但养殖困难的鱼类PGC移植入经济价值一般但养殖简单的鱼类中；另一方面可以缩短繁殖周期，如将繁殖周期较长的鱼类PGC移植入繁殖周期较短的鱼类中；最后，利用该方法还可以实现珍稀种质资源的活体保藏，如将珍稀或濒危鱼类的PGC移植到常见鱼类中。总而言之，鱼类的生殖细胞移植或替换技术方法多种多样且具有很强的实际应用意义，仅PGC移植就包括了囊胚期PGC细胞团移植技术、单PGC移植技术及PGC分选后移植技术等，研究者可根据自己的实际需要选择合适的方法及供受体进行实验。本文以CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼pou5f3基因结合囊胚期PGC细胞团移植技术为例，描述该方法的具体操作步骤。

1. 实验准备
   1. 移植用玻璃毛细管的制备：首先，用拉针仪将玻璃毛细管拉出一个尖端（参数如下：Heat 530，Pull 60，Vel 60，Time 60，Pressure 200），然后用煅针仪在其尖端直径50至60 μm的位置将其熔断，最后将熔断的针尖在磨针仪上磨成45度斜口，如图1。
   2. 1.5%琼脂糖平皿的制备：称取1.5 g琼脂糖粉末于250 mL锥形瓶中，加入100 mL纯水，微波加热煮沸至琼脂糖粉末完全溶解，稍凉后倒入90 mm塑料平皿，以刚好铺满平皿底部为宜，待其凝固后用于鱼苗的饲养。
   3. 移植用平皿的制备：在90 mm平皿中倒入约30 mL溶解好的1.5%琼脂糖，待其稍凉至手可触摸但尚未开始凝固时，将移植模具（图2A）缓慢倒扣于琼脂糖液面上，待其完全凝固后，先用尖镊子或刀片沿着模具四边划一下，然后从其一侧短边向上拔出模具，即得到移植用平皿（图2B）。
   4. 实验用鱼的配对：实验前一天，按照雌、雄比为1:1或2:1的比例将成年斑马鱼放置于配种缸，用隔板分开。
   5. 供体胚胎的制备：实验当天早晨，抽去隔板，让前一天配对的斑马鱼自然交配，收集1细胞期斑马鱼胚胎，并将400 ng/μL cas9-UTRnos3 mRNA，80 ng/μL pou5f3 gRNA，200 ng/μL GFP-UTRnos3 mRNA及200 ng/μL buc mRNA与0.5%酚红溶液（酚红溶液的配置和使用见溶液配方部分）混合后共注射到1细胞期斑马鱼胚胎中（视频1），在28.5 °C培养箱于0.3× Danieau's buffer中培养3小时，至1000细胞期。其中cas9-UTRnos3 mRNA和pou5f3 gRNA共同作用可在PGC中引起目的基因的高效突变(Moreno-Mateos et al., 2015; Zhang et al., 2020)，GFP-UTRnos3 mRNA表达荧光蛋白，用于标记供体PGC(Köprunner et al., 2001)，buc mRNA 可增加供体PGC数目从而提高PGC移植成功率(Bontems et al., 2009; Krishnakumar et al., 2018; Zhang et al., 2020)。
      
      
      
      视频1. 斑马鱼胚胎的显微注射
      
      
   6. 受体胚胎的制备：将100 μM dead end吗啉反义寡核苷酸（dnd MO）（序列为5′-GCTGGGCATCCATGTCTCCGACCAT-3′）注射至1细胞期斑马鱼胚胎中以完全剔除受体自身内源性PGC (Weidinger et al., 2003)，并在28.5 °C培养箱于0.3× Danieau's buffer中与供体胚胎同步发育。
   7. 胚胎脱壳：为避免对移植后的胚胎存活率造成较大影响，我们选择机械法而非酶解法对胚胎进行脱壳操作。28.5 °C恒温培养约2.5小时后，在荧光显微镜下挑选出荧光较强的供体胚胎，将其置于0.3× Danieau's buffer中，用1 mL的注射器的针尖将其卵壳剥除，受体胚胎同时也需剥除卵壳，见视频2。待供、受体胚胎发育至1000细胞期，即3 hpf（hours post fertilization）时开始进行PGC移植。
      
      
      
      视频2. 斑马鱼胚胎卵壳剥除
      
      
2. PGC移植过程
   1. 胚胎排列：将去除卵壳的供体和受体囊胚依次摆入移植用平皿（图2B）的凹槽中，动物极朝上放置，右边两排为供体胚胎，左边四排为受体胚胎（一颗供体胚胎中取得的PGC，可分别移植到两颗受体胚胎中）。PGC细胞团移植在1× Danieau's buffer中进行。
   2. 注射针安装：将Eppendorf油压细胞移植器（图3A）的持针器（图3B）固定到显微操作仪（图3C）上，然后将制备好的移植用玻璃毛细管安装到持针器上（图3D）。
   3. 移植用玻璃毛细管的位置及管内液面调节：利用显微操作仪控制玻璃毛细管的移动，将针尖缓慢伸入液面下，直至在显微镜下能清楚地观察到针尖位置。利用eppendorf油压细胞移植器缓慢排出针尖中的液体（可在针尖末端留少许液体）。
   4. 供体PGC的吸取：囊胚期PGCs分4簇位于胚盘边缘位置（图4A），将玻璃毛细管的针尖插入供体囊胚中，利用eppendorf油压细胞移植器从供体胚盘边缘位置（图4B）吸取可能包含PGC的细胞团（约60-100个细胞），具体操作见视频3。
   5. PGC细胞团的注射：利用eppendorf油压细胞移植器将吸取到的供体PGC细胞团缓慢注射到受体囊胚边缘位置（图4C），具体操作见视频3。
      
      
      
      视频3. 斑马鱼囊胚期PGC移植
      
      
3. PGC移植后胚胎的饲养
   1. 移植后1小时，将受体胚胎从移植用平皿转移至琼脂糖平皿中，在0.3× Danieau's buffer中，28.5 °C恒温培养。
   2. 受体胚胎培养至35 hpf左右，在荧光显微镜下挑选出PGC移植阳性胚（图4C）并饲养至成鱼。
   3. 使用过的移植用平皿用清水冲洗干净后可至于4 °C冰箱保存，一般可重复使用3次。
      
      
      图1. 囊胚期PGC细胞团移植用针尖端图示
      
      
      图2. 移植模具（A）及PGC移植用平皿（B）图示
      
      
      图3. 斑马鱼PGC细胞团移植仪器设备
      
      
      图4. 斑马鱼PGC细胞团移植过程图示

结果与分析

1. 如表1所示，将斑马鱼pou5f3基因敲除后的胚胎作为供体进行囊胚期PGC细胞团移植，移植后35小时（35 hpf）胚胎的存活率在29.6%至55.8%之间，此时以受体胚胎生殖嵴处可观察到被GFP标记的PGC为衡量标准来计算PGC移植成功率，则其成功率在18.7%到24.4%。当然，这是供体中过表达了buc mRNA诱导了额外PGC的结果，若不用buc mRNA 进行PGC诱导，则其PGC移植成功率一般在14%左右(Zhang et al., 2020)。
2. 斑马鱼的pou5f3基因编码一个重要的多能性因子，该基因具有很强的母源表达，且对早期胚胎发育是必需的(Reim et al., 2004; Reim and Brand, 2006; Lee et al., 2013)。利用CRISPR/Cas9结合囊胚期PGC细胞团移植，我们共得到了10尾可产生该基因突变配子的成鱼，其中1尾雌鱼，9尾雄鱼（图5A，表1）。将1号雌鱼和2号雄鱼自交后，F1代胚胎表现出原肠运动缺陷及严重的背部化表型（图5B）。基因表达分析显示，与野生型胚胎相比，pou5f3在F1代突变体早期发育过程中几乎不表达（图5C），而在胚盾期（6 hpf），背部组织者基因chd表达量显著上调，腹侧中胚层的标记基因eve1的表达显著下调，内胚层的标记基因sox32和sox17几乎不表达（图5D）。更重要的是体节的标记基因myoD的表达在突变体胚胎的腹侧融合，且脊索的标记基因ntl在突变体中出现分叉表达，这可能是由于突变体早期胚胎发育过程中的外包缺陷所造成的。该表型及相关标记基因的表达谱与前人所描述的pou5f3母源合子突变体的表型及基因表达变化一致(Reim et al., 2004; Reim and Brand, 2006)。以上结果表明，我们利用CRISPR/Cas9结合PGC移植技术在F1代成功得到了pou5f3的母源合子突变体，证实该技术适用于快速建立早期发育必需基因的母源合子突变体。
   
   
   图5. 利用CRISPR/Cas9结合PGC移植快速得到斑马鱼pou5f3的母源合子突变体. A. 每条移植阳性成鱼（1♀, 9♂）的配子突变率。B. 1号雌鱼与2号雄鱼交配子代从sphere期到24 hpf的表型。相较于野生型，shield期突变体胚胎的胚环更厚，原肠期外包运动受到严重影响，受精后24小时一簇细胞在背侧的顶部堆积（LV, 侧视图; DV, 背视图）. C. 与野生型中pou5f3高量表达相比，突变体在早期发育过程中pou5f3几乎不表达。D. 与野生型相比，突变体胚胎中chd的表达沿着胚环向腹侧延伸，而eve1的表达在突变体中显著降低；内胚层的标记基因sox32和 sox17在突变体中检测不到表达；体节的标记基因myoD的表达在突变体胚胎的腹侧融合，且脊索的标记基因ntl在突变体中出现分叉表达。
   
   表1. PGC移植阳性率及成鱼可育性统计
   

   Gene name	Test No.	No. of transplant	No. of survivors at 35 hpf (%)	No. of successful PGCT embryos (%)	No. of survival adults	No. of fertile adults	No. of adults producing mutant embryo
   pou5f3	1	108	32 (29.6)	6 (18.7)	3 (1♀2♂)	1 (1♀0♂)	0
   	2	97	45 (46.4)	11 (24.4)	8 (1♀7♂)	4 (1♀3♂)	3 (0♀3♂)
   	3	113	63 (55.8)	15 (23.8)	13 (1♀12♂)	7 (1♀6♂)	7 (1♀6♂)

   
   

失败经验

1. 移植阳性率很低。可能原因：a.移植用玻璃毛细管的开口直径太小；b.吸取供体PGC时未吸取下部胚盘边缘位置的细胞。解决办法：a.将移植用玻璃毛细管的开口直径控制在50-60 μm；b.尽量吸取下部胚盘边缘位置的细胞以增加PGC移植的成功率。
2. 移植后大量胚胎发育异常或畸形。可能原因：移植的供体细胞团所含细胞量过多。解决办法：控制好供体细胞团所含细胞量，一般在60-100个细胞。
3. 移植后的胚胎发黑，死亡率高。可能原因：a.玻璃毛细管内吸入了太多溶液并注射到了受体胚胎；b.移植用玻璃毛细管的针尖有玻璃碎渣；c.将供体PGC移植到受体囊胚时，针尖碰到了受体的卵黄合胞层（yolk syncytial layer，也称卵黄多核层）（图6）。解决办法：a.吸取供体PGC时，尽量不要吸到溶液；b. 移植用玻璃毛细管的针尖磨完后可用20%氢氟酸于通风橱中处理3 s以去除碎玻璃渣并用去离子水将针尖洗净（氢氟酸为剧毒试剂，具有强腐蚀性，请务必在通风橱内谨慎操作）；c.将供体PGC移植到受体囊胚时，避免针尖触碰到受体的卵黄合胞层。
   
   
   图6. PGC移植位置及卵黄合胞层示意图
   
   
4. 将供体PGC细胞团注射入受体胚胎时受体胚胎被吹破。可能原因：a.油压细胞移植器中有气泡导致灵敏度大大降低；b.未能及时控制供体细胞的排出。解决办法：a.排出油压细胞移植器中的气泡；b.注射供体细胞时不用将针尖内的供体细胞全部排出，可留少部分在针尖内。
   

溶液配方

1. 30× Danieau's buffer
   NaCl                         20.34 g
   KCl                            0.313 g
   MgSO₄∙7H₂O           0.592 g
   Ca(NO₃)₂∙4H₂O        0.850 g
   HEPES7.120 g
   H₂O至200 ml
   注：利用10 M NaOH调pH至7.2，母液可于-80 °C冷冻过夜灭菌。稀释后需加青链霉素双抗（100×）使用。
2. 0.5% 酚红
   称取0.5 g酚红，加去离子水100 mL； 混合后放在磁力搅拌器上搅拌30分钟左右；酚红中如存在块状的，需要先在纸上揉碎，否则会造成溶解困难。充分溶解后，使用0.45 μm无菌注射过滤器过滤。注射的时候，稀释酚红终浓度至0.05%。
   

致谢

国家斑马鱼资源中心得到科技部财政部国家科技资源共享服务平台；国家重点研发计划（2018YFA08010000）；中国科学院生物资源科技服务网络计划动物实验平台项目；湖北省自然科技资源库等项目的支持。该实验方法改编自之前的研究工作(Zhang et al., 2020)。

参考文献

1. Bontems, F., Stein, A., Marlow, F., Lyautey, J., Gupta, T., Mullins, M. C. and Dosch, R. (2009). Bucky ball organizes germ plasm assembly in zebrafish.Curr Biol 19(5): 414-422.
2. Köprunner, M., Thisse, C., Thisse, B. and Raz, E. (2001). A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells.Genes Dev 15(21): 2877-2885.
3. Krishnakumar, P., Riemer, S. and Perera, R. (2018). Functional equivalence of germ plasm organizers. 14(11): e1007696.
4. Lee, M. T., Bonneau, A. R., Takacs, C. M., Bazzini, A. A., DiVito, K. R., Fleming, E. S. and Giraldez, A. J. (2013). Nanog, Pou5f1 and SoxB1 activate zygotic gene expression during the maternal-to-zygotic transition. Nature 503(7476): 360-364.
5. Moreno-Mateos, M. A., Vejnar, C. E., Beaudoin, J. D., Fernandez, J. P., Mis, E. K., Khokha, M. K. and Giraldez, A. J. (2015). CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.Nat Methods 12(10): 982-988.
6. Reim, G. and Brand, M. (2006). Maternal control of vertebrate dorsoventral axis formation and epiboly by the POU domain protein Spg/Pou2/Oct4. Development 133(14): 2757-2770.
7. Reim, G., Mizoguchi, T., Stainier, D. Y., Kikuchi, Y. and Brand, M. (2004). The POU domain protein spg (pou2/Oct4) is essential for endoderm formation in cooperation with the HMG domain protein casanova.Dev Cell 6(1): 91-101.
8. Weidinger, G., Stebler, J., Slanchev, K., Dumstrei, K., Wise, C., Lovell-Badge, R., Thisse, C., Thisse, B. and Raz, E. (2003). dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol 13(16): 1429-1434.
9. Zhang, F. H., Li, X. M., He, M. D., Ye, D., Xiong, F., Amin, G., Zhu, Z. Y. and Sun, Y. H. (2020). Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells.Journal of Genetics and Genomics 47(1): 37-47. <Go to ISI>://WOS:000524095600004