小鼠卵胞质内孤雄单倍体胚胎干细胞注射
Mouse Intracytoplasmic AG-haES Cell Injection   

材料与试剂

1. 10CM培养皿
2. 6CM培养皿
3. 国产玻璃针
4. 毛细管电极（Sutter Instrument公司，产品目录号：B100-75-10）
5. 手持式移卵针
6. Mineral oil (Sigma公司，产品目录号：M8410)
7. EmbryoMax^® Ultra Pure Water, sterile H2O(Millipore公司，产品目录号：TMS-006-A)
8. NaCl (Sigma公司，产品目录号：S5886)
9. KCl (Sigma公司，产品目录号：P5405)
10. MgSO₄·7H₂O (Sigma公司，产品目录号：M1880)
11. EDTA-Na₂ (Sigma公司，产品目录号：E6635)
12. DL-lactate solution (Sigma公司，产品目录号：L7900)
13. D-(+)-Glucose (Sigma公司，产品目录号：G6152)
14. KH₂PO₄ (Sigma公司，产品目录号：P5655)
15. Poly(vinyl alcohol) (Sigma公司，产品目录号：P8136)
16. Hepes·2Na (Sigma公司，产品目录号：H0763)
17. NaHCO₃ (Sigma公司，产品目录号：S5761)
18. Sodium pyruvate (Sigma公司，产品目录号：P4562)
19. Glutamine (Merck Millipore公司，产品目录号：TMS-002-C)
20. Hyaluronidase简称Hy ( Sigma公司，产品目录号：H3884)
21. Cytochalasin B简称CB (Sigma公司，产品目录号：C6762)
22. Polyvinylpyrrolidone 简称PVP（Sigma公司，产品目录号：PVP360)
23. Phenol red (Sigma公司，产品目录号：P0290)
24. BSA (Sigma公司，产品目录号：A3311)
25. KSOM medium (Merck Millipore公司，产品目录号：MR-106-D)
26. Pregnant mare serum gonadotropin简称PMSG (宁波三生药业)
27. Chorionic Gonadotropin for injection简称HCG (宁波三生药业)
28. 氯化钠注射液(山东华鲁制药有限公司)
29. CZB Stock(1L)（见溶液配方）
30. H-CZB Stock（见溶液配方）
31. Hepes-CZB（见溶液配方）
32. CZB（见溶液配方）
33. CaCl₂·2H₂O(100×stock)（见溶液配方）
34. 2%透明质酸酶溶液(HY)（见溶液配方）
35. CB-HCZB（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 拉针仪（SUTTER INSTRUMENT公司，型号：P-97）
2. 煅针仪（NARISHIGE公司，型号：MF-900）
3. 体式显微镜（NIKON公司，型号：SMZ800N）
4. 倒置显微镜（OLYMPUS公司，型号：IX73）
5. 显微操作系统（品牌：NARISHIGE，型号：IM-9C）
6. 压电式破膜仪PIEZO（EPPENDORF公司，型号：PiezoXpert）
7. 热台（品牌：TOKRI HIT，型号：TPX-SQFT）
8. 离心机（EPPENDORF公司，型号：5430）
9. 超洁净工作台（品牌：万里，型号：SW-CJ-2FX）
10. 二氧化碳恒温培养箱（THERMO公司，型号：i160）
11. 安全柜（THERMO公司，型号：1300 SERIES A2）
12. 倒置相差显微镜配备4X、10X、20X镜头（完整装置见图A）
    
    
    图A 显微注射系统
    
    
13. 倒置相差显微镜热台
14. 超声清洗机
    

实验步骤

（一）持卵针及注射针的制备

1. 持卵针：使用程序HEAT：755 PULL：40 VEL：120 TIME：125拉制两根玻璃针。（HEAT的温度是根据不同的机器及毛细管电极材质确定的，Sutter InstrumentP-97等型号的拉针仪带有自动检测程序可以测定针的熔点，HEAT温度应接近或高于其熔点，这样才能融化并拉开针，其他属性的调整请参照仪器说明书或咨询工程师）
2. 用砂轮将针断至合适的粗细，确保针的外径约100 µm左右，断口处尽量确保平整。
3. 将针装上煅针仪，调节合适的加热温度，通过加热的方式，将断口处收紧至15 µm左右，一根好的固定针的标准是外径与内径分别是卵母细胞直径的90%和20%。
4. 如果显微操作仪需要使用一定角度的针，将针横向放置，通过在针一侧加热的方式将之弯折至需要的角度，一般角度在15度左右。
5. 注射针：使用程序HEAT：760 PULL：40 VEL：120 TIME：120拉制两根玻璃针
6. 将针装上煅针仪，调节合适的加热温度，通过加热的方式，将针在玻璃珠上断至合适的粗细，确保针的内径约8 µm左右，断口处要尽量确保平整，尖端可能略有弯折，但不影响使用。
7. 如果显微操作仪需要使用一定角度的针，将针横向放置，通过一侧加热的方式将针弯折至需要的角度，一般角度在15度左右。

1. (取卵前62小时)8周龄左右的F1雌鼠，通过腹腔注射的方式注射5IU PMSG。
2. (取卵前14小时)PMSG注射48小时后，通过腹腔注射方式注射5IU HCG。
3. 在6cm无菌培养皿中使用CZB制作培养碟，每100 µl的CZB宜制作6个液滴，每个培养皿应含有30个液滴以上(以便具有足够的新鲜溶液进行充分洗涤)，加完CZB后，使用矿物油封住液面，置于培养箱中平衡。
4. 通过断颈法（或其他符合动物福利的方法）处死小鼠，搜集两侧的输卵管膨大部至Hepes-CZB中，重复操作直至取出全部小鼠的输卵管膨大部。
5. 在体视显微镜下，用1mL注射器划破输卵管膨大部的透明处，释放其中的卵团，用注射器完整挑取卵团至新的100 µlHepes-CZB中去，重复此操作直至转移完所有的卵团。
6. 加入100 µl含有HY的Hepes-CZB，37度培养箱消化1分钟，取出用200uL枪头吹打数次，再消化30秒直至卵丘细胞全部解离，立刻取出培养箱。
7. 用手持式持卵针迅速将还在消化液中的卵母细胞转移至新鲜的Hepes-CZB中去，反复洗涤几次，直至HY无残留。
8. 将卵母细胞移至CZB的液滴中，洗涤次数应当保证溶液已经彻底被替换为CZB。
9. 在37度5%二氧化碳培养箱中培养卵母细胞30分钟后进行注射实验。
   
   
   

1. （注射前12小时)挑选孤雄单倍体胚胎干细胞合适密度生长的培养孔，每1ml培养基添加8 µl的秋水仙素碱。
2. （注射前30分钟)使用0.05%的胰蛋白酶/EDTA溶液，消化孤雄单倍体胚胎干细胞3分钟左右，吹打数次，立即加入培养基中止消化（消化时间需要控制不超过4分钟，否则细胞会变得很黏，影响后续注射）。
3. 120g水平转子离心机离心5分钟，将上清吸出。
4. 用100 µl的Hepes-CZB重悬细胞，然后置于冰上，如果细胞密度较高，也可以使用更大量进行稀释。

1. 使用CZB、KSOM、激活液制作培养皿，每100µl的培养液宜制作6个液滴，每个培养皿应含有30个液滴以上(以便具有足够的新鲜溶液进行充分洗涤)，加完培养液后，使用矿物油封住液面，两个不同的培养皿均置于培养箱中平衡。
2. 使用微量上样器从注射针的尾部向针内加入约2-3 mm高的汞（有的系统中，使用无毒性的重油替代有毒的汞），将注射针和持卵针安装上显微操作仪，在专用的注射皿或10 CM培养皿盖中，制作出数个CB-HCZB小液滴，每100 µl的液体宜制作8个液滴，以及一个PVP液滴，并使用矿物油封住液面（完整的装置见图B）。
   
   
   图B
   
   
3. 打开热台，将PIEZO脉冲强度及频率均设置为5，在PVP液滴中将针头洗涤数次，最后在一个CB-HCZB液滴中将针头部分彻底洗至无杂质且左右吹吸顺畅无阻滞感为止。
4. 用手持式移卵针吸取适量的培养在CZB中的卵母细胞，加入到注射皿的CB-HCZB中，卵母细胞应根据操作者的习惯加在注射针的同一侧，这样在注射中可以与注射过的卵母细胞加以区分。
5. 用移液枪吹打孤雄单倍体胚胎干细胞，然后置于冰上1分钟等待其自然沉底。
6. 用手持式移卵针吸取少量位于上层的含有孤雄单倍体胚胎干细胞的Hepes-CZB，加入到注射皿的CB-HCZB中。（因为体外培养的孤雄单倍体胚胎干细胞并非完全都在单倍体时期，而单倍体比二倍体小，因此沉降时较缓慢，相对位于上层）
7. 若以上步骤如果完成较快，可以略微等待数分钟，确保CB-HCZB中的细胞松弛素B发挥作用，阻止Actin的聚合，进而影响卵母细胞以及孤雄单倍体胚胎干细胞的细胞骨架。
8. 将卵母细胞固定在持卵针上，确保卵母细胞的纺锤体不在注射侧，PIEZO脉冲档调节到合适的程度（使用汞的系统，一般使用强度2，频率1即可），将注射针顶在透明带上，轻踩脉冲，观察透明带是否被打穿，如果没有打穿可以再踩一次或者调高脉冲强度，直至打穿，将透明带残片用注射针吸出弃于一边。注意一定不能同时将卵母细胞膜破坏。
9. 调整视野，用注射针吸取一个阻滞良好的孤雄单倍体胚胎干细胞（即便采用了沉降法，依然有不少的细胞属于二倍体甚至四倍体，因此需要挑选直径与针尖大小类似的细胞，同时由于添加了秋水仙素碱使得细胞阻滞在中期，选取的应该是细胞无法观察到明显的细胞核的），再次调整视野找到之前打穿的透明带位置，将细胞置于注射针前端，穿过透明带上的小孔将注射针插入卵胞质中直至靠近持卵针的位置，轻踩脉冲（一般使用汞的系统，使用强度1，频率1即可），应观察到孤雄单倍体胚胎干细胞破裂并被脉冲推出注射针头，同时位于针前端的卵母细胞膜会因为受到脉冲破裂。
10. 轻轻地按反方向抽出注射针，在即将拔出卵胞质时，用注射针吸取一点带细胞膜的卵胞质，并随着针一起抽出卵母细胞，这一步是为了将卵母细胞的口封住，由于使用了PIEZO脉冲系统，如果不可以封口会导致卵母细胞破裂。
11. 将注射后的卵母细胞移到另一侧，重复上述操作，直至该组卵母细胞全部注射完毕。
12. 将注射过的卵母细胞移到CZB液滴中洗涤数次。
13. 重复加入另一组卵母细胞，直至所有的卵母细胞都注射完毕。
14. 在最后一组卵母细胞注射完并移到CZB液滴培养30分钟后，将所有的胚胎移至KSOM液滴中，注意胚胎早期发育需要消耗大量培养基中的营养物并代谢出酸性废物，因此每一个液滴中的胚胎数量不宜太多，一般每个液滴不超过20枚胚胎。
15. 37度5%二氧化碳浓度条件培养胚胎直至2细胞形成。

结果与分析

1. 注射完第二天，可以观察到两细胞形成。
2. 在2细胞时期，或者囊胚时期可以进行胚胎移植，进一步获得半克隆小鼠，详情请参阅小鼠胚胎移植章节。
   

失败经验

1. 超排效果差，卵母细胞少。
   一般超排结果不好是由于很多因素中的一个或者多个同时发生导致的，首先应当检查激素浓度及注射剂量有无问题，然后检查所使用的小鼠，不同品系的小鼠超排的效果很不一样，推荐使用大于8周龄的B6D2F1 (C57BL/6xDBA/2)母鼠进行超排，同时激素注射的时间非常影响结果，需要严格控制打药以及取卵时间窗口。
2. 取卵过程中卵母细胞死亡很多。
   可能是因为操作时间太久了，需要保证卵团消化的时间不要太久，如果初次速度比较慢或卵团比较多，可以分批多次取卵，或在室温进行卵团消化。另外工作浓度的试剂由于不含抗生素成分，需进行分装并保存在4度且尽快用完，过久的试剂可能影响实验效果。
3. 取卵过程中虽然能划出卵团，但很难被针头挑取。
   一般是打药时间不对，HCG注射后14小时即可取到卵，但随时间推移，卵团的卵丘细胞会慢慢解离，造成卵团松散无法被挑取。所以即便注射HCG后20小时后仍然可以取到卵，但可能卵整体的质量和数量都会收到影响。
4. 注射时针经常堵。
   如洗不干净可以通过更换注射针解决。堵针最大的原因是因为卵胞质内的物质接触针内部，尤其当其接触到汞柱的时候会导致注射针内壁过于黏而难以清洗干净，在注射时应当避免造成卵母细胞的死亡，因为卵母细胞的死亡伴随着大量的卵胞质的释出，导致周边液体粘稠度变高，但对于初学者，往往又很难避免卵母细胞的死亡，推荐每一组的卵母细胞不要太多，大约10到20颗左右，并且每一组就换一个新鲜的CB-HCZB液滴。
5. 注射完的胚胎经常死。
   一般死在刚注射后的胚胎是因为注射操作造成，尤其是封口操作不熟练导致，熟练提升技术后可以解决。
6. 胚胎状态很差，很多没有到两细胞的，或者两细胞的状态不好，一个卵裂球很大一个很小。
   胚胎状态是很多因素共同决定的，如果排除培养基的问题以及培养箱温湿度、二氧化碳浓度的问题。可能是注射操作对胚胎造成了太大的损伤，这种损伤可能来自于脉冲过于强，破坏了卵母细胞的遗传物质或者是因为注射时间过长，导致胚胎长时间处在含有细胞松弛素的环境中、甚至可能是油封液面过低，导致培养过程中培养基组分蒸发而改变浓度。同时孤雄单倍体胚胎干细胞的状态起决定性的因素，细胞应事先进行鉴定，不存在支原体污染。正确的挑选阻滞良好的单倍体胚胎干细胞是成功的关键，初学者可以在吸取细胞后直接打碎，观察是否存在细胞核（阻滞在中期的细胞只有纺锤体，没有成型的细胞核，因此打碎后呈现流沙状，并很快消失不见，而间期的细胞打碎后仍然有一个小且致密的团块，且不随时间推移而消失），熟练掌握选取细胞后，再练习注射。
7. 孤雄单倍体胚胎干细胞黏在一起，很难挑选，或很脆，在吸入时就碎裂了。
   在CB-HCZB中浸泡时间过久的细胞会变得粘稠，并互相粘连在一起，此时不仅影响观察，也很难选取正确的细胞，因此一开始加入的细胞密度较为关键，由于细胞数远大于卵母细胞数，因此在保证足够注射量细胞的情况下尽可能少加些细胞。注射时细胞容易碎裂往往是因为注射时间过久，细胞长期摆放在冰上所致，单次的注射时间应该控制在4小时之内，细胞状态较好的时间内完成。
   

溶液配方

1. CZB Stock(1L)
   EmbryoMax® Ultra Pure Water, sterile H2OUp to 1000 mL
   NaCl 4760 mg
   KCl 360 mg
   MgSO₄·7H₂O 290 mg
   EDTA-Na₂ 40 mg
   DL-lactate solution 5.3 ml
   D-(+)-Glucose1000 mg
   KH₂PO₄ 160 mg
   混匀后0.22 μm滤器过滤，4度保存。
2. H-CZB Stock
   CZB Stock500 ml
   Poly(vinyl alcohol) 50 mg
   待Poly(vinyl alcohol) 溶解后用0.22 μm滤器过滤除菌，4度保存。
3. Hepes-CZB
   H-CZB Stock98.5 ml
   HEPES476 mg
   NaHCO₃ 42 mg
   CaCl₂·2H₂O (100×stock)1 ml
   Pyruvate3.0 mg
   Glutamine (200×stock)0.5 ml
   加入100 μl酚红，用盐酸调整pH至7.4，混匀0.22 μm滤器过滤可在4度保存两周
4. CZB
   CZB Stock98.5 ml
   NaHCO₃ 211 mg
   CaCl₂·2H₂O (100×stock)1 ml
   Pyruvate3.0 mg
   Glutamine (200×stock)0.5 ml
   BSA500 mg
   混匀后0.22 μm滤器过滤，可在4度保存两周。
5. CaCl₂·2H₂O (100×stock)
   CaCl₂·2H₂O2500 mg
   EmbryoMax^® Ultra Pure Water, sterile H₂O100 ml
6. 2%透明质酸酶溶液(HY)
   透明质酸酶 (Hyaluronidase)200 mg
   Hepes-CZB10 ml
   混匀，100 μl分装，-20度保存，使用时加入900μlHepes-CZB。
7. CB-HCZB
   Hepes-CZB1 ml
   CB10 μg
   10μg CB分装储存在EP管中于-20度保存，使用时加入1mL Hepes-CZB混匀。
   

参考文献

1. Yang, H., Shi, L., Wang, B. A., Liang, D., Zhong, C., Liu, W., Nie, Y., Liu, J., Zhao, J., Gao, X., Li, D., Xu, G. L. and Li, J. (2012). Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell 149(3): 605-617.
2. Zhong, C., Yin, Q., Xie, Z., Bai, M., Dong, R., Tang, W., Xing, Y. H., Zhang, H., Yang, S., Chen, L. L., Bartolomei, M. S., Ferguson-Smith, A., Li, D., Yang, L., Wu, Y. and Li, J. (2015). CRISPR-Cas9-Mediated Genetic Screening in Mice with Haploid Embryonic Stem Cells Carrying a Guide RNA Library. Cell Stem Cell 17(2): 221-232.